Наш протокол имеет важное значение, поскольку позволяет исследователям исследовать молекулярный механизм коронарного ангиогенеза вне организма. Основным преимуществом этой методики является то, что она точно моделирует процесс коронарного ангиогенеза внутри организма, облегчая изучение механизмов коронарного ангиогенеза. Начните с распыления беременной мыши проведения эмбрионального дня 11,5 эмбрионов с 70%этанола.
Подъем кожи над животом с типами, использовать ножницы, чтобы сделать брюшную кожу и брюшной разрез боковой и передней до диафрагмы подвергать рога матки. Хватая матку, вырезать ткани бесплатно и вытащить матки рога. Поместите строку эмбрионов в ледяной стерильный PBS под стерео микроскопом, и снять мышцы матки, желточный мешок, и амнион покрытия от каждого эмбриона.
Поскольку каждый эмбрион изолирован, используйте перфорированную ложку для переноса тканей в новую чашку Петри, содержащую стерильные PBS на льду. Чтобы собрать эмбрионационную сердечную ткань, перенесите первый эмбрион, который будет расчленен в новую чашку Петри под микроскопом, и поместите эмбрион в брюшной стороне вверх. Используйте тонкие типсы, чтобы сделать небольшой разрез в груди, немного выше диафрагмы, и вставьте закрытые типсы в разрез, чтобы увеличить разрез.
Используя типсы, чтобы держать грудную стенку открытой, чтобы разоблачить сердце и легкие, используйте вторую пару типсов, чтобы мягко переместить сердце передне на 90 градусов, чтобы разоблачить спинную аорту и вену. Затем, хватая эти сосуды у основания сердца, осторожно вытяните сердце и легкие передней и промойте ткани холодным PBS. Когда все сердечные ткани были собраны, поместите образцы сердца под микроскопом и удалить легочные доли из каждого сердца.
Ориентируя первое сердце на спинную сторону и удерживая сердце у его основания, используйте тонкие типсы, чтобы соскребать левую и правую атрию в соседних тканях, окружающих СВ от сердца. Чтобы изолировать SV, сориентировать сердце спинной стороны вверх. Тщательно удалите SV из сердца и используйте стерильный пипетки передачи разместить изолированную ткань в новую шестиметровую чашку Петри, содержащую ледяной стерильный PBS на льду.
Чтобы изолировать все желудочков, удалить отток тракта и использовать новые стерильные передачи пипетки для места желудочков в отдельные шесть сантиметров Петри блюдо, содержащее ледяной стерильной PBS на льду. Чтобы создать SV и целые желудочковые культуры, сначала покрыть мембраны одного восьмимиметрового поры ПЭТ культуры вставить на колодец 24 хорошо культуры пластины, с 100 микролитров свежеотбавленных внеклеточной матрицы на культуру, по крайней мере 30 минут при 37 градусов по Цельсию. Когда матрица затвердеет, используйте передачу пипетки для передачи одного explant на каждую вставку, и переместить пластину под микроскопом.
Используя чистые типсы, распоите explants в центре каждой вставки, чтобы убедиться, что они не прикреплены к боковым стенкам, и тщательно удалить любые дополнительные PBS. Затем перенесите пластину с закрытой крышкой под капотом культуры ламинарного потока и добавьте 100 микролитров предварительно разогретой полной среды к каждой вставке и 200 микролитров к значительно ниже каждой вставки. Затем добавьте 300 микролитров PBS в любые неиспользованные скважины и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение пяти дней.
Для лечения VEGF-A на второй день культуры, удалить среду из обеих камер каждой культуры и добавить 100 микролитров PBS для каждой вставки, и 200 микролитров PBS к каждой хорошо. После закрученного пластины несколько раз, заменить PBS с 300 микролитров базальной среды дополняется 1%фетальной сыворотки крупного рогатого скота, чтобы начать культур, и вернуть пластину в инкубатор. На третий день после голодания добавьте 300 микролитров свежей базальной среды плюс сыворотку в контрольные скважины и базальную среду плюс 50 нанограмм на миллилитр VEGF-A в лечебные скважины и верните пластину в инкубатор клеточной культуры.
На шестой день культуры, мыть камеры с PBS, как попродемонстрировано, и исправить культур с 200 микролитров 4%paraformaldehyde в каждой хорошо, и 100 микролитров фиксатора в каждой вставке. После 20 минут при температуре 4 градуса По Цельсию с качания, мыть культур с 300 микролитров PBS в течение 10 минут за стирку с качания при комнатной температуре. После последней стирки добавьте 300 микролитров первичного раствора антител в колодцы и вставьте для ночной культуры при четырех градусах Цельсия с раскачиванием.
На следующее утро, мыть культур 10 раз в неионных сурфактант в PBS с качания, изменение мытья раствор каждые 10 минут, прежде чем маркировки культур с 300 микролитров соответствующих фторфора конъюгированных вторичных антител на четыре градуса Цельсия ночь с качания. На следующий день, мыть культуры 10 раз в свежем PBS с неионной сурфактант, как попродемонстрировано. После последней стирки используйте тонкие типсы, чтобы тщательно очистить мембрану от каждой вставки и поместить мембраны на отдельные стеклянные микроскоп слайды, explant вверх.
Обложка образцов с DAPI дополнены монтажной среды в крышку скольжения, и печать края крышки скользит с четким лаком для ногтей. Когда лак для ногтей высохнет, изображение слайдов конфокальные микроскопии. По мере того как начальные клетки SV растут на желудочек сердца, они останавливают производить венозные маркеры such as Coup-TF2.
После пяти дней культуры, SV эндотелиальных клеток прорастают и мигрируют на мембрану. Как и в эмбриональном сердце, экспрессия Coup-TF2 уменьшается по мере того, как сосуды мигрируют от СВ. Культуры, стимулируемые VEGF-A, демонстрируют повышенный рост ангиогенных ростков как по плотности, так и по длине. Дальнейшие культуры СВ, стимулируемые VEGF-A, демонстрируют почти трехкратное увеличение длины ростков по сравнению с контрольами, что свидетельствует о том, что эндотелиальные ростки из СВ и эндокарда реагируют на VEGF-A.
Важно не потерять ткани SV, вытаскивая сердце и легкие, удаляя атрию, и очистки прилегающих тканей, окружающих СВ. Эксперименты с живой визуализацией могут быть проведены для визуализации коронарного ангиогенеза и для захвата деталей клеточной и молекулярной динамики во время процесса. Этот метод чрезвычайно полезен для оценки потенциальных молекулярных механизмов коронарного ангиогенеза и в качестве образцовой системы для изучения ангиогенеза в целом.
