Для неонатальных заболеваний, таких как кардиомиопатия, регенеративная терапия с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток имеет огромный потенциал. Однако ускоренный рост клеток в пробирке приводит к повреждению ДНК накопленными метаболитами, такими как реактивные виды кислорода. Трансплантация этих поврежденных ДНК клеток приведет к плохой при пересадке и регенерации органа.
Перед трансплантацией необходимо оценить качество клеток. Здесь мы предоставляем два пошаговых протокола для оценки повреждения ДНК в стволовых клетках. Демонстрация процедур будет Джессика Миллер, исследователь, Nikhil Mardhekar, исследователь, и Vasanthi Rajasekaran, лаборант.
Для начала поместите 500 миллиграммов низкоплавильной агарозы в 100 миллилитров ДНК-РНК свободной воды. Нагрейте бутылку в микроволновой печи, пока агароза не растворится. Затем поместите бутылку в 37-градусную ванну с водой до тех пор, пока это необходимо.
Чтобы подготовить предварительно покрытые слайды кометы, поместите несколько капель 0,5%agarose на стеклянную горку. Немедленно выложить агарозу, чтобы сформировать тонкий слой агарозного покрытия с помощью крышки. Работая в условиях низкой освещенности, чтобы избежать повреждения клеток, вызванных ультрафиолетовым светом, смешайте 10 микролитров клеточной подвески и 90 микролитров раствора агарозы в трубке.
Поместите трубку в 37-градусную ванну с водой, чтобы предотвратить затвердевающую агарозу. Смешайте раствор без введения пузырьков воздуха и пипетки 70 микролитров на место на предварительно покрытой кометной горке. Используя наконечник пипетки, распределить смесь агарозы клетки, чтобы сформировать тонкий слой.
Поместите слайд при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. В контейнере полностью погрузите горку в холодный лизный буфер. Поместите контейнер в темноте при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа.
Замените буфер лиза холодным щелочным раствором. Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду. Оставив контейнер в темноте при четырех градусах по Цельсию еще на 30 минут, поместите горку в горизонтальный электрофорезный бак.
Заполните бак холодным щелочным электрофорезным буфером до тех пор, пока горки не будут полностью погружены в воду. Нанесите напряжение на один вольт на сантиметр в течение 15-30 минут. В контейнере полностью погрузим горку в холодную деионизированную воду.
Через две минуты снимите деионизированную воду и добавьте свежую деионизированную воду, а затем повторите этот шаг во второй раз. Далее замените деионизированную воду холодным 70%этанолом. Через пять минут аккуратно удалите слайд, не наклоняя его и дайте ему высохнуть.
После того, как сушеные, добавить 100 микролитров разбавленного красителя ДНК в каждом месте, и ждать 15 минут при комнатной температуре. Используя фильтр FITC в микроскопе эпифлуоресценции, сделайте снимки от 50 до 100 комет в общей сложности на образец. Культура iPS-производных кардиомиоцитов, как описано в текстовом протоколе.
Чтобы увидеть кардиомиоциты, полученные iPS, в камерных слайдах, сначала выбросьте культурную среду из колодцев и трижды промыте клетки с помощью PBS. Добавьте один миллилитр 0,25%трипсина на колодец и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Проверьте пластину под микроскопом для клеточного отслоения.
Затем добавьте один миллилитр CMM, чтобы остановить трипсин. Поместите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и 200 раз г. Откажитесь от среды, добавьте один миллилитр МММ и повторно посовелите клетки.
Подсчитайте клетки и отрегулируйте количество клеток, чтобы получить два миллиона клеток в 1,6 миллилитров CMM. Теперь семя 200 микролитров клеточной подвески на колодец из восьми-хорошо камеры слайда. Нажмите слайд осторожно, чтобы распространить клетки вокруг хорошо.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию. Для лечения кардиомиоцитов доксорубицина, полученных iPS, отбросить культурную среду из колодцев кардиомиоцитов, полученных iPS, и промыть клетки с помощью PBS. Лечить клетки с одномомолярного доксорубицина в течение четырех часов при 37 градусах по Цельсию.
Аспирировать среды, и мыть клетки с PBS. Для выполнения иммунолабеля, мыть клетки три раза с PBS и добавить 200 микролитров свежеприготовленных 4%paraformaldehyde к каждому хорошо. Исправить клетки в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре.
После мытья клеток с PBS, добавить 200 микролитров блокирующего буфера на колодец, и блок в течение 30 минут в увлажненной камере при комнатной температуре. Удалите блокирующий буфер и добавьте 200 микролитров первичного раствора антител. После инкубации в течение 45 минут в темной увлажненной камере при комнатной температуре, мыть колодцы три раза с PBS.
Удалите PBS и добавьте 200 микролитров вторичной смеси антител. Инкубировать в течение 45 минут в темной увлажненной камере при комнатной температуре. Затем мыть колодцы три раза с PBS.
Вымойте деионизированной водой перед монтажом горок с антифадой. Поместите крышку стекла, и хранить слайды в темноте при четырех градусах по Цельсию. Используя конфокальный микроскоп, сделайте три-пять изображений случайных полей на образец и приступайте к анализу изображений.
Для подсчета ДНК повреждения ответ foci, скачать и установить CellProfiler. Выберите файл, импорт, конвейер из файла и выберите файл конвейера под названием puncti gamma-H2AX. Перетащите и опустите папку, содержащую приобретенные изображения гамма-H2AX foci, в окно списка файлов в разделе изображений входных модулей для анализа.
Затем следуйте инструкциям, как показано в текстовом протоколе. Чтобы установить параметры для изображений, перетащите нужное изображение для анализа в список файлов. Под входные модули выберите изображения.
Также в входных модулях выберите метаданные, а затем выберите имена и типы. Для групп выберите нет. Работая в аналитических модулях, выберите цвет серый.
Затем выберите гладкий, выберите определить основные объекты, и снова выберите гладкой. Далее выберите улучшить или подавить функции, а затем выбрать определить основные объекты. По-прежнему работая в аналитических модулях, выберите связанные объекты, затем классифицируем объекты и, наконец, выберите экспорт в электронную таблицу.
Нажмите проанализировать изображения в нижней левой панели для выполнения анализа изображений. При успешном завершении анализа генерируется несколько изображений. Обратите внимание на файл CSV, который генерируется и сохраняется в соответствующем месте на компьютере.
Этот файл содержит количественные данные для дальнейшего анализа. В электронной таблице, называемой моим экспериментальное изображение, столбец B будет иметь количество ядер, которые имеют до пяти puncti, и столбец D будет иметь количество ядер, которые имеют более пяти puncti. Добавьте столбцы B и D, чтобы получить общее количество ядер.
Повторите эти шаги для всех изображений, изменив имя файла эксперимента перед каждым анализом. Здесь показаны репрезентативные микрографы комет из доксо-обработанных и необработавных клеток iPS. Базальное количество повреждений ДНК было обнаружено в клетках iPS, выраженное как доля повреждения ДНК и хвостовой момент.
Тем не менее, лечение доксо увеличило повреждение ДНК в клетках iPS, как и ожидалось, что указывает на то, что анализ кометы может быть использован для оценки целостности ДНК в плюрипотентных стволовых клетках. Здесь показаны репрезентативные микрографы иммунолабеля гамма-H2AX при более низком увеличении и при более высоком увеличении. В контрольных кардиомиоцитах, полученных iPS, более 90% клеток имели менее пяти DDR foci на ядра.
И в общей сложности менее 10% клеток имели более шести DDR foci на ядра. Для кардиомиоцитов, полученных iPS, которые культурированы в течение шести месяцев, менее 90% клеток имели до пяти DDR foci на ядра, и в общей сложности более 13% клеток имели более шести DDR foci на ядра. В то время как в доксо-обработанных иПС полученных кардиомиоцитов, менее 80% клеток было до пяти DDR очагов на ядра.
И в общей сложности около 24% клеток имели более шести DDR foci на ядра. Эти данные свидетельствуют о том, что длительная культура клеток кардиомиоцитов, полученных iPS, и лечение доксо индуцируют значительные повреждения ДНК, что делает их непригодными для трансплантации клеток. Очень важно избегать переменных при смешивании клеточной подвески, так как это может повлиять на электрофорез.
Следуя этой процедуре, вы можете выполнить анализ кометы и иммунолабеля процедуры с клетками различных типов. Эти методы позволят для клеток различных видов, которые будут оцениваться на повреждение ДНК, прежде чем использоваться в исследованиях трансплантации клеток.
