该方法试图描述三种常用的方法，用于评估正常嗜中性粒细胞在体内和体外迁移，以及病理嗜中性粒细胞在小鼠关节炎模型中的渗透。我们认为这种方法对于该领域的其他研究人员可能有用。该协议包含的方法细节，以评估嗜中性粒细胞在炎症点使用空气袋测定和辅助诱导关节炎的迁移能力。
通过将模型组与治疗组进行比较，该技术对关节炎治疗的影响延伸到了关节炎治疗中。这种方法可以提供炎症性疾病的见解，并可应用于炎症性肠病。演示程序将是清一路和海旭江，研究生从我们实验室。
在零日对小鼠进行麻醉后，使用连接到五毫升注射器的0.22微米过滤器获得三毫升的灭菌空气。用钳子抬起麻醉小鼠的后皮，用 26 量表 3/8 英寸针注射三毫升灭菌空气。治疗后，将小鼠从呼吸装置中取出，并放入井架。
监测小鼠，以确保它们还活着，直到它们开始四处走动。第三天，将另外三毫升的消毒空气注入先前建立的气囊，以维持空气袋。第六天，将不同的治疗注射到空气袋中。
注射一毫升PBS作为负对照，并注射每毫升LPS一毫升一微克作为正对照诱导局部炎症。六个小时后，牺牲老鼠。对于每个空气袋，注射一毫升的洗涤缓冲液来清洗空气袋，并在15毫升离心管中收集炎症的出水液。
然后用两毫升的洗涤缓冲液清洗空气袋两次，并在同一离心管中收集炎症的排泄液。在室温下以100倍g离心10分钟。丢弃上流液，将细胞重新在一毫升的洗涤缓冲液中。
使用自动血液学分析仪计算细胞数值以量化嗜中性粒细胞比率。通过旋转至少五秒钟，将 100 微升悬浮液放入胰岛素注射器中，暂停完成 Freund 的辅助剂。麻醉后，标记所选的爪子，从喷油器将 20 微升完整的 Freund 辅助剂注入脚踝关节空间的四个近侧点。
将加工过的老鼠放入新房间。监测小鼠，以确保它们呼吸，直到他们重新获得移动能力。每三天，使用袖珍厚度计测量脚踝关节直径。
此外，评估关节炎的严重程度，以关节炎评分标准。零是正常的。没有红斑和肿胀的证据。
一种是最轻微的关节炎。Erythema 和轻度肿胀仅限于柏油或脚踝关节。二是中度关节炎。
Erythema 和轻度肿胀从脚踝延伸到焦油。三是严重的关节炎。Erythema 和中度肿胀从脚踝延伸到骨质关节。
四是最严重的关节炎。红斑和严重的肿胀包括脚踝，脚和数字，或肢体的骨病。牺牲鼠标后，用钳子和剪刀从后腿取出皮肤和部分肌肉。
用70%乙醇喷洒关节，用纸巾去除其余肌肉。在室温下将脚踝关节固定为4%甲醛两天。然后在室温下将接头在 10%EDTA 中脱花一个月，并每周更换介质。
一个月后，将组织放在一个标记的模具中，在大约60摄氏度的液体石蜡中嵌入组织。简单地冷却。将微原子上的厚度设置为四微米并切割切片。
然后将部分漂浮在43摄氏度的水浴中，以在短时间内扩大部分。将部分安装到幻灯片上，并在 70 摄氏度下将幻灯片放入烤箱两小时。为将来使用，请将幻灯片保存在零下 20 摄氏度。
接下来，将幻灯片放在机架中，根据手稿对二甲苯和乙醇进行洗涤，在室温下进行补水。最后，用自来水洗三分钟。然后在0.1%的快速绿色溶液中染色5分钟。
用1%醋酸冲洗10秒，用0.1%的Safranin O染色溶液染色20分钟。之后，根据手稿将幻灯片浸入二甲苯和乙醇洗涤解决方案中。将组织部分安装到对象阶段，并在显微镜下观察组织。
要可视化嗜中性粒细胞，首先在 78 摄氏度下烘烤石蜡部分两个小时，进行免疫组织化学染色。将幻灯片放在机架中，根据手稿执行二甲苯、乙醇、水和 PBS 洗涤，在室温下进行补水。然后加入一滴渗透缓冲液覆盖组织。
在37摄氏度的湿度控制托盘中孵育部分10分钟。之后，在 PBS 中冲洗幻灯片三分钟三次。避免直接冲洗组织。
接下来，执行热诱导抗原表位检索。将幻灯片排列在机架中。将幻灯片浸入充满检索缓冲器的压力锅炉中。
将压力锅炉放入微波炉中，将微波炉设置为 600 瓦，加热幻灯片 10 分钟。煮沸后，将锅炉中的滑梯冷却至90摄氏度。拿出幻灯片，在 PBS 中冲洗三分钟三次。
要淬火内源过氧化物酶活性，将幻灯片浸入新鲜准备的3%过氧化氢室温下15分钟。在 PBS 中冲洗幻灯片三分钟三次。用疏水笔在样品周围勾勒出一个大圆圈。
避免接触样品。将 50 至 100 微升的 3%牛血清白蛋白添加到样品中，将样品在 37 摄氏度的湿度控制室中阻挡并放置 60 分钟。然后删除阻塞解决方案。
快速将50微升PBS稀释原抗体加入到每个部分。在四摄氏度的湿度控制托盘中孵育滑梯。第二天，拿出托盘，让它在室温下站立30分钟。
然后在 PBS 中冲洗幻灯片三分钟三次。向组织添加50微升PBS稀释的二级抗体。在37摄氏度的湿度控制托盘中孵育滑梯30分钟。
然后在 PBS 中冲洗幻灯片三分钟三次。在稀释的DAB溶液中开发五分钟。避免因民建联反应过度而出现深色。
用蒸馏水冲洗滑梯。将幻灯片用赤氧林中计数器 10 秒钟，然后用自来水冲洗幻灯片 5 分钟。在酸性酒精中超快的分化溶液中冲洗三秒钟，然后在自来水中冲洗10分钟。
根据手稿，将幻灯片浸入乙醇和二甲苯的室温下清洗。使用安装解决方案固定盖玻片。在显微镜下观察组织。
在这项研究中，进行了空气袋实验，以调查体内LPS刺激的嗜中性粒细胞招募。空气袋中出出的白细胞子集比控制中的白细胞子集高得多。与对照组相比，辅助性诱发关节炎组在爪子上表现出显著的水肿。
脚踝关节直径增加，关节炎评分持续上升。软骨损伤是类风湿性关节炎的代表性综合征。CFA的挑战导致大量的白细胞渗透，严重的软骨侵蚀，和突触增生。
任何表达水平的MPO都是中性粒细胞渗透的代表性标志物，在关节部分被明显调节。确保空气被注入皮肤，而不是注入肌肉。我们也可以研究通过免疫组织化学染色的脚踝关节组织部分与抗p84或这些方法可用于研究其他炎症性疾病，如炎症性肠病的中性粒细胞外陷阱的形成。
