Questo metodo cerca di descrivere tre metodi frequentemente utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili normali in vivo e in vitro, nonché l'infiltrazione di neutrofili patologici nel modello di artrite del topo. Riteniamo che questo metodo potrebbe essere utile per altri ricercatori in questo campo. Questo protocollo contiene i dettagli metodologici per valutare la capacità migratoria dei neutrofili nei siti di infiammazione utilizzando il test della busta d'aria e l'artrite indotta da adiuvanti.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dell'artrite confrontando il gruppo di modelli con il gruppo di trattamento. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sulle malattie infiammatorie e può essere applicato alla malattia infiammatoria intestinale. A dimostrare la procedura saranno Qingyi Lu e Haixu Jiang, studenti post-laurea del nostro laboratorio.
Dopo l'anestesia dei topi il giorno zero, utilizzare un filtro da 0,22 micron collegato a una siringa da cinque millilitri per ottenere un volume di tre millilitri di aria sterilizzata. Sollevare la pelle posteriore del topo anestetizzato con una pinzetta e utilizzare per via sottocutanea un ago da 26 calibro per 3/8 pollici per iniettare tre millilitri dell'aria sterilizzata. Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità respiratoria e metterli in una gabbia ben impostata.
Monitora i topi per assicurarti che siano vivi fino a quando non iniziano a muoversi. Il terzo giorno, iniettare altri tre millilitri di aria sterilizzata nella tasca dell'aria precedentemente stabilita per sostenere la busta d'aria. Il sesto giorno, iniettare diversi trattamenti nella busta d'aria.
Iniettare un millilitro di PBS come controllo negativo e iniettare un millilitro di un microgrammo per millilitro LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale. Dopo sei ore, sacrifica i topi. Per ogni sacchetto d'aria, iniettare un millilitro di tampone di lavaggio per lavare la busta d'aria e raccogliere l'essudato infiammatorio in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Quindi lavare la busta d'aria con due millilitri di tampone di lavaggio due volte e raccogliere l'essudato infiammatorio nello stesso tubo di centrifuga. Centrifuga a 100 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di tampone di lavaggio.
Contare le cellule per quantificare il rapporto neutrofilo utilizzando l'analizzatore di ematologia automatica. Sospendere l'adiuvante completo di Freund vortice di almeno cinque secondi, quindi disegnare 100 microlitri di sospensione in un iniettore di insulina. Dopo l'anestetismo, contrassegnare la zampa scelta e iniettare 20 microlitri del coadiuvante completo di Freund dall'iniettore in quattro punti periarticolari sullo spazio dell'articolazione della caviglia.
Metti i topi lavorati nella nuova camera. Monitora i topi per assicurarti che respirino fino a quando non riacquistano la capacità di muoversi. Ogni tre giorni, utilizzare uno spessore tascabile per misurare il diametro dell'articolazione della caviglia.
Inoltre, valutare la gravità dell'artrite in base al criterio di punteggio dell'artrite. Zero è normale. Nessuna prova di eritema e gonfiore.
Uno è l'artrite più lieve. Eritema e lieve gonfiore confinato ai tarsali o all'articolazione della caviglia. Due è l'artrite moderata.
Eritema e lieve gonfiore che si estende dalla caviglia ai tarsali. Tre è la grave artrite. Eritema e gonfiore moderato che si estende dalla caviglia alle articolazioni metatarsali.
Quattro è l'artrite più grave. L'eritema e il forte gonfiore comprendono la caviglia, il piede e le cifre, o anchilosi dell'arto. Dopo aver sacrificato il mouse, rimuovere la pelle e parte del muscolo dalla gamba posteriore con pinzette e forbici.
Spruzzare l'articolazione con il 70% di etanolo e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta. Fissare l'articolazione della caviglia in paraformaldeide al 4% per due giorni a temperatura ambiente. Quindi decalcificare il giunto in EDTA al 10% per un mese a temperatura ambiente e cambiare il mezzo settimanale.
Dopo un mese, posizionare il tessuto in uno stampo marcato con un certo volume di paraffina liquida a circa 60 gradi Celsius per incorporare il tessuto. Raffreddare brevemente. Impostare lo spessore sul microtomo a quattro micrometri e tagliare le fette.
Quindi galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua di 43 gradi Celsius per un breve periodo per espandere le sezioni. Montare le sezioni su scivoli e mettere gli scivoli nel forno a 70 gradi Celsius per due ore. Per un uso futuro, conservare le diapositive a meno 20 gradi Celsius.
Quindi, posizionare le diapositive in un rack ed eseguire lavaggi in xilene ed etanolo secondo il manoscritto per reidratare a temperatura ambiente. Infine, lavare in acqua corrente del rubinetto per tre minuti. Quindi macchiare la soluzione verde veloce dello 0,1% per cinque minuti.
Risciacquare in acido acetico all'1% per 10 secondi e macchiare in soluzione di colorazione 0,1%Safranin O per 20 minuti. Successivamente, immergere le diapositive nelle soluzioni di lavaggio dello xilene e dell'etanolo secondo il manoscritto. Montare le sezioni di tessuto sullo stadio dell'oggetto e osservare i tessuti al microscopio.
Per visualizzare i neutrofili, eseguire la colorazione immunoistochimica cuocendo prima le sezioni di paraffina per due ore a 78 gradi Celsius. Posizionare le diapositive in un rack ed eseguire i lavaggi di xilene, etanolo, acqua e PBS secondo il manoscritto per reidratarsi a temperatura ambiente. Quindi aggiungere una goccia di tampone di permeabilizzazione per coprire il tessuto.
Incubare le sezioni in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Evitare di risciacquare direttamente il tessuto.
Successivamente, eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore. Disporre le diapositive in un rack. Immergere le diapositive nella caldaia a pressione riempita con tampone di recupero.
Mettere la caldaia a pressione nel forno a microonde e impostare il forno a microonde a 600 watt e riscaldare gli scivoli per 10 minuti. Dopo l'ebollizione, mantenere le diapositive nella caldaia raffreddare a 90 gradi Celsius. Esezioni le diapositive e sciacquarle in PBS per tre minuti tre volte.
Per placare l'attività endogena della perossidasi, immergere i vetrini in perossido di idrogeno appena preparato al 3% a temperatura ambiente per 15 minuti. Risciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Delineare un grande cerchio intorno al campione con una penna idrofobica.
Evitare di toccare il campione. Aggiungere al campione da 50 a 100 microlitri di albumina di siero bovino al 3% per bloccare e posizionare i campioni in una camera controllata dall'umidità a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi rimuovere la soluzione di blocco.
Aggiungere rapidamente 50 microlitri di anticorpi primari diluiti PBS a ciascuna sezione. Incubare gli scivoli in un vassoio controllato dall'umidità a quattro gradi Celsius durante la notte. Il secondo giorno, eserti dal vassoio e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Aggiungere 50 microlitri di anticorpi secondari diluiti PBS ai tessuti. Incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Sviluppare in soluzione DAB diluita per cinque minuti. Evitare lo sviluppo di un colore scuro causato dalla reazione eccessiva del DAB.
Risciacquare gli scivoli in acqua distillata. Controsostenere le diapositive in ematossilina per 10 secondi e sciacquare gli scivoli in acqua del rubinetto per cinque minuti. Risciacquare in alcol acido soluzione di differenziazione super veloce per tre secondi, quindi risciacquare in acqua del rubinetto per 10 minuti.
Immergere le diapositive nei lavaggi di etanolo e xilene a temperatura ambiente secondo il manoscritto. Fissare il coperchio con la soluzione di montaggio. Osservare il tessuto al microscopio.
In questo studio, sono stati eseguiti esperimenti di sacchetto d'aria per indagare il reclutamento di neutrofili stimolato dall'LPS in vivo. I sottoinsiemi di leucociti negli essudati della busta d'aria erano molto più alti che nel controllo. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo di artrite indotta da coadiuvanti ha mostrato un edema significativo nella zampa.
Il diametro dell'articolazione della caviglia è aumentato e il punteggio di artrite è aumentato costantemente. Il danno alla cartilagine è la sindrome rappresentativa dell'artrite reumatoide. La sfida CFA ha indotto una grande quantità di infiltrazione di leucociti, significativa erosione della cartilagine e iperplasia sinoviale.
Mpo in qualsiasi livello di espressione sono marcatori rappresentativi di infiltrazione neutrofila che sono stati significativamente upregolati nella sezione articolare. Assicurarsi che l'aria sia iniettata nella pelle, ma non nel muscolo. Possiamo anche studiare la formazione di trappole extracellulari neutrofile mediante colorazione immunoistochimica delle sezioni del tessuto articolare della caviglia con anti-p84 o Questi metodi possono essere utilizzati per studiare altre malattie infiammatorie come la malattia infiammatoria intestinale.
