Этот протокол позволяет нам исследовать клеточный цикл на уровне отдельных клеток с помощью массового цитометра, и это позволяет провести несколько новых исследований и клинических исследований. Главным преимуществом этой методики является ее простота. IdU добавляется непосредственно к клеткам, и нет необходимости в дальнейшем лечении или антителах.
Мы использовали этот метод для исследования состояния клеточного цикла у пациентов с острым миелоидным лейкозом в отделах стволовых клеток и клеток-предшественников. И это продемонстрировало, что свойства клеточного цикла этих конкретных типов клеток могут коррелировать с клиническим исходом пациентов с этими заболеваниями. Этот метод может быть полезен для понимания ростовых свойств редких раковых клеток и понимания пролиферации подмножеств иммунных клеток.
До и после добавления IdU в образцы клеток поддерживайте клетки в интересующих условиях роста. В этом случае увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию при 5% CO2 для маркировки клеток IdU, разбавляет концентрированный исходный раствор IdU от одного до 50 в питательной среде клеток. Затем перенесите образцы в колпак биобезопасности и добавьте 10 микролитров одного миллимолярного IdU к каждому миллилитру клеток.
Верните клетки в инкубатор на 10-15 минут перед переносом образцов в отдельные конические пробирки. Соберите клетки центрифугированием в конические пробирки объемом 15 миллилитров и ресуспендируйте гранулы в 200 микролитрах PBS на пробирку. При необходимости пометьте клетки соответствующим живым/мертвым окрашиванием, чтобы пометить мертвые клетки.
После живого/мертвого окрашивания клетки закаляли средами, промытыми CSM, а затем фиксировали клетки 25 микролитрами 16% параформальдегида. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре соберите клетки центрифугированием. Добавьте от пяти до 15 миллилитров CSM и снова центрифугу.
Ресуспендируют гранулы в 500 микролитрах среды для окрашивания клеток, дополненной 10% диметилсульфоксидом. Затем переложите клетки в меньшие пробирки, чтобы хранить их при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы нормализовать анализ клеточного цикла, импортируйте файлы в соответствующую программу анализа проточной цитометрии и создайте двухосный график длины события по сравнению со 191 иридием.
Клетки образуют отчетливую яркую популяцию с высоким содержанием иридия. Измените шкалу длины события, чтобы ячейки выглядели более заметными. Затем создайте синглетный затвор, чтобы исключить от 50 до 60% дублетов и мусора, и установите остаточные и смещенные параметры Гаусса, чтобы удалить все оставшиеся дублеты и обломки.
Чтобы установить затвор S-фазы, создайте двухосный график зависимости IdU от маркера пролиферации. IdU-положительные клетки S-фазы образуют отдельную популяцию. Для стробирования G0/G1 и G2/M установите вентили на графике зависимости IdU от циклина B1.
Фаза G0 / G1 будет низкой циклином B1, отрицательным IdU, а фаза G2 / M будет высокой циклином B1, отрицательным IdU. Чтобы получить доступ к определенным типам клеток, постройте только ячейки S-фазы на графике циклина B1 и IdU, чтобы помочь установить разделение между фазой G0 / G1 и фазовыми ячейками G2 / M. Нарисуйте ворота вокруг высокой популяции Cyclin B1.
В некоторых случаях это может быть трудно различить, но уровень циклина B1, составляющий примерно верхние 5% популяции S-фазы, обычно является точкой разрыва между фазовыми затворами G0/G1 и G2/M. Клетки, находящиеся в пределах предыдущих ворот, будут популяцией фазы G2/M, а остальная часть будет популяцией фазы G0/G1. Чтобы установить популяцию фазы G0, создайте фосфорилированный белок ретинобластомы по сравнению с графиком IdU.
Фаза G0 будет представлена фосфорилированным белком ретинобластомы с низким IdU-отрицательным составом. Поскольку активная циклическая популяция продемонстрирует высокий фосфорилированный белок ретинобластомы и инкорпорацию IdU, на этой границе можно нарисовать фазовые ворота G0, поскольку они обычно экспрессируются в двух разных популяциях. Если ворота G0 трудно определить, сделайте популяцию S-фазы активной популяцией и нарисуйте ворота, включающие от 90 до 100% высокой популяции фосфорилированного белка ретинобластомы.
Низкая популяция фосфорилированного белка ретинобластомы за пределами ворот обычно представляет собой популяцию G0, в то время как клетки G0 / G1 с уровнями pRb, которые попадают в эти ворота, являются клетками G1. Для стробирования в М-фазе создайте IdU по сравнению с фосфорилированным гистоном H3 с помощью осевого графика. Фаза М-фазы будет наблюдаться как очень малая часть клеток в популяции фосфорилированных гистонов H3.
Клетки в популяции G2 / M с более низким уровнем pHH3 являются клетками G2. Если включение IdU не удалось или было невозможно, определите циклические и нециклические клеточные фракции, используя Ki67 и фосфорилированный белок ретинобластомы. Двойная положительная популяция будет представлять активную велосипедную популяцию, коррелирующую с G1, S, G2 и M-фазами.
Двойная низкая популяция будет представлять собой невелосипедную популяцию, коррелирующую с фазой G0. После того, как все ворота будут установлены, экспортируйте числовые значения из ворот. Проценты в каждом цикле могут быть достигнуты путем вычитания отдельных популяций из объединенных популяций для получения числовых значений для каждой отдельной фазы клеточного цикла для последующего построения графиков и статистического анализа.
Создание синглетных ворот важно для разделения клеточного мусора и дублетов, чтобы обеспечить изоляцию одиночной клеточной популяции. Затем может быть выполнен анализ клеточного цикла отдельных клеток. Маркировка IdU и, следовательно, последующий анализ клеточного цикла могут существенно зависеть от времени и температуры.
Например, клетки, которые слишком долго остаются в закрытых сосудах или в транспорте между местами, будут иметь уменьшенные фракции S-фазы, и это не будет точным для анализа клеточного цикла. Образцы клеток, хранящиеся в течение коротких периодов времени в час или меньше, по-прежнему демонстрируют нормальное распределение клеточного цикла, что указывает на то, что быстрая транспортировка не может негативно повлиять на анализ. Криоконсервированные клетки могут потребовать длительного периода равновесия, прежде чем клетки вернутся к активному клеточному циклу, который все еще может не отражать состояние клеточного цикла до криоконсервации.
Различные типы клеток также могут по-разному зависеть от условий обслуживания. Например, в этом образце костного мозга человека Т-клетки продемонстрировали снижение количества клеток по сравнению с монобластами из того же образца. Еще одним преимуществом массовой цитометрии является способность различать клетки при остановке клеточного цикла или с аномальным распределением клеточного цикла.
Основным преимуществом этого метода является то, что он легко совместим с другими измерениями масс-цитометрии, такими как поверхностное фенотипирование, структура хроматина, стимуляция внутриклеточных цитокинов, которые могут быть коррелированы с состоянием клеточного цикла. Мы использовали этот метод для изучения истощения иммунных клеток, старения и для того, чтобы показать, что реакция на химиотерапию у пациентов с острым лейкозом может коррелировать со свойствами клеточного цикла лейкозных клеток.
