Bu protokol, kütle sitometresini kullanarak hücre döngüsünü tek hücre düzeyinde incelememizi sağlar ve bu, birkaç yeni araştırma ve klinik çalışmanın yapılmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı basitliğidir. IdU doğrudan hücrelere eklenir ve daha fazla tedaviye veya antikorlara gerek yoktur.
Bu tekniği, kök ve progenitör hücre bölmelerinde akut miyeloid lösemili hastalarda hücre döngüsü durumunu araştırmak için kullandık. Ve bu, bu spesifik hücre tiplerinin hücre döngüsü özelliklerinin, bu hastalıkları olan hastaların klinik sonuçları ile ilişkili olabileceğini göstermiştir. Bu teknik, nadir kanser hücrelerinin büyüme özelliklerini anlamak ve bağışıklık hücresi alt kümelerinin çoğalmasını anlamak için yararlı olabilir.
Hücre örneklerine IdU eklemeden önce ve sonra, hücreleri ilgilenilen büyüme koşullarında tutun. Bu durumda, hücreleri IdU ile etiketlemek için% 5 CO2'de nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatör, konsantre IdU stok çözeltisini hücrelerin büyüme ortamına bir ila 50 arasında seyreltin. Daha sonra numuneleri bir biyogüvenlik başlığına aktarın ve her bir mililitre hücreye 10 mikrolitre bir milimolar IdU ekleyin.
Numuneleri tek tek konik tüplere aktarmadan önce hücreleri inkübatöre 10 ila 15 dakika boyunca geri döndürün. Hücreleri 15 mililitrelik konik tüplerde santrifüjleme yoluyla toplayın ve peletleri tüp başına 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Gerekirse, ölü hücreleri işaretlemek için hücreleri uygun bir canlı / ölü leke ile etiketleyin.
Canlı / ölü lekeyi takiben, hücreleri 25 mikrolitre% 16 paraformaldehit ile sabitlemeden önce CSM ile yıkanmış ortamlarla söndürün. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Beş ila 15 mililitre CSM ekleyin ve tekrar santrifüj yapın.
Peletleri% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenmiş 500 mikrolitre hücre boyama ortamında tekrar askıya alın. Daha sonra hücreleri negatif 80 santigrat derecede saklamak için daha küçük tüplere aktarın. Hücre döngüsü analizini normalleştirmek için, dosyaları uygun bir akış sitometri analiz yazılımı programına aktarın ve 191 iridyuma karşı olay uzunluğunun iki eksenli bir grafiğini oluşturun.
Hücreler belirgin bir parlak iridyum yüksek popülasyonu oluşturacaktır. Hücrelerin daha belirgin görünmesini sağlamak için olay uzunluğu ölçeğini değiştirin. Ardından, çiftlerin ve döküntülerin %50 ila 60'ını hariç tutmak için bir singlet kapısı oluşturun ve kalan çiftleri ve kalıntıları kaldırmak için artık ve ofset Gauss parametrelerini ayarlayın.
S-faz kapısını ayarlamak için, bir çoğalma işaretleyicisine karşı IdU'nun iki eksenli bir grafiğini oluşturun. S-fazı IdU pozitif hücreler ayrı bir popülasyon oluşturacaktır. G0 / G1 ve G2 / M geçidi için, kapıları bir IdU'ya karşı Cyclin B1 grafiğinde oluşturun.
G0 / G1 fazı Siklin B1 düşük, IdU negatif ve G2 / M fazı Siklin B1 yüksek, IdU negatif olacaktır. Belirli hücre tiplerine geçiş yapmak için, G0/G1 fazı ile G2/M faz hücreleri arasındaki ayrımı belirlemeye yardımcı olmak için Cyclin B1 ve IdU grafiğinde yalnızca S-fazı hücrelerini çizin. Cyclin B1 yüksek popülasyonunun etrafına bir kapı çizin.
Bazı durumlarda, bunu ayırt etmek zor olabilir, ancak S-faz popülasyonunun yaklaşık% 5'inin Siklin B1 seviyesi tipik olarak G0 / G1 ve G2 / M faz kapıları arasındaki kesme noktasıdır. Önceki kapıda bulunan hücreler G2 / M faz popülasyonu olurken, geri kalanı G0 / G1 faz popülasyonu olacaktır. G0 faz popülasyonunu oluşturmak için, IdU grafiğine karşı fosforile edilmiş bir retinoblastoma proteini oluşturun.
G0 fazı, fosforile retinoblastoma proteini düşük, IdU negatif popülasyon ile temsil edilecektir. Aktif döngü popülasyonu yüksek fosforile retinoblastoma proteini ve IdU katılımı göstereceğinden, G0 faz kapısı tipik olarak iki ayrı popülasyonda ifade edildiği gibi bu sınıra çizilebilir. G0 kapısının tanımlanması zorsa, S-fazı popülasyonunu aktif popülasyon haline getirin ve fosforile retinoblastoma proteini yüksek popülasyonunun en üst% 90 ila% 100'ünü içeren bir kapı çizin.
Kapının dışındaki fosforile retinoblastoma proteini düşük popülasyonu tipik olarak G0 popülasyonudur, bu kapıya düşen pRb seviyelerine sahip G0 / G1 hücreleri ise G1 hücreleridir. M-faz geçişi için, eksenel grafik ile fosforile histon H3'e karşı bir IdU oluşturun. M-faz fazı, fosforile histon H3 popülasyonundaki hücrelerin çok küçük bir fraksiyonu olarak gözlenecektir.
G2 / M popülasyonundaki pHH3 seviyeleri daha düşük olan hücreler G2 hücreleridir. IdU katılımı başarısız olduysa veya mümkün değilse, Ki67 ve fosforile retinoblastoma proteini kullanarak döngü hücre fraksiyonlarını değil, döngüyü tanımlayın. Çift pozitif popülasyon, G1, S, G2 ve M-fazları ile ilişkili aktif bisiklet popülasyonunu temsil edecektir.
Çift düşük nüfus, G0 fazı ile ilişkili bisiklete binmeyen popülasyonu temsil edecektir. Tüm kapılar kurulduktan sonra, sayısal değerleri kapılardan dışa aktarın. Her döngüdeki yüzdeler, sonraki grafik ve istatistiksel analiz için her bir hücre döngüsü aşaması için sayısal değerler üretmek üzere birleştirilmiş popülasyonlardan tek popülasyonları çıkararak elde edilebilir.
Singlet kapısının kurulması, hücresel enkazın ayrılması ve tek hücre popülasyonunun izolasyonuna izin vermek için çifte katlanması için önemlidir. Daha sonra tek hücrelerin hücre döngüsü analizi yapılabilir. IdU etiketleme ve dolayısıyla aşağı akış hücre döngüsü analizi, zaman ve sıcaklıktan önemli ölçüde etkilenebilir.
Örneğin, kapalı damarlarda veya yerler arasında taşımada çok uzun süre kalan hücreler, S-faz fraksiyonlarını azaltacak ve bu hücre döngüsü analizi için doğru olmayacaktır. Bir saat veya daha kısa süreler boyunca tutulan hücre örnekleri hala normal bir hücre döngüsü dağılımı göstermektedir, bu da hızlı bir nakliyenin analizi olumsuz etkilemeyebileceğini göstermektedir. Kriyokorunmuş hücreler, hücreler aktif hücre döngüsüne dönmeden önce uzun bir denge periyodu gerektirebilir, bu da kriyoprezervasyon öncesi hücre döngüsü durumunu hala yansıtmayabilir.
Farklı hücre tipleri de bakım koşullarından farklı şekilde etkilenebilir. Örneğin, bu insan kemik iliği örneğinde, T hücreleri, aynı numunedeki monoblastlara kıyasla hücre sayılarında bir azalma göstermiştir. Kütle sitometrisinin bir diğer yararı, hücre döngüsü durması sırasında veya anormal hücre döngüsü dağılımına sahip hücreleri ayırt etme yeteneğidir.
Bu tekniğin en büyük avantajı, yüzey fenotiplemesi, kromatin yapısı, hücre içi sitokin uyarımı gibi hücre döngüsü durumu ile ilişkilendirilebilen diğer kütle sitometri ölçümleriyle kolayca uyumlu olmasıdır. Bu tekniği, bağışıklık hücresi tükenmesini, yaşlanmasını incelemek ve akut lösemili hastalarda kemoterapiye verilen yanıtın lösemi hücrelerinin hücre döngüsü özellikleri ile ilişkili olabileceğini göstermek için kullandık.
