このプロトコルにより、マスサイトメーターを使用して単一細胞レベルで細胞周期を調べることができ、これにより、いくつかの新しい研究や臨床研究を行うことができます。この手法の主な利点は、その単純さです。IdUは細胞に直接添加され、さらなる治療や抗体は必要ありません。
この技術を使用して、急性骨髄性白血病患者の幹細胞コンパートメントと前駆細胞コンパートメント内の細胞周期状態を調査しました。そしてこれは、これらの特定の細胞型の細胞周期特性がこれらの疾患を有する患者の臨床転帰と相関し得ることを実証した。この手法は、希少がん細胞の増殖特性を理解し、免疫細胞サブセットの増殖を理解するのに役立ちます。
細胞サンプルにIdUを添加する前後に、細胞を目的の増殖条件に維持する。この場合、加湿した摂氏37度のインキュベーターを5%CO2で細胞にIdUで標識し、濃縮されたIdUストック溶液を細胞の増殖培地に1〜50に希釈する。次に、サンプルをバイオセーフティフードに移し、1ミリリットルの細胞ごとに1ミリモルのIdUを10マイクロリットル加えます。
細胞をインキュベーターに10〜15分間戻してから、サンプルを個々のコニカルチューブに移します。15ミリリットルのコニカルチューブで遠心分離して細胞を収集し、チューブあたり200マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。必要に応じて、適切な生/死染色で細胞を標識し、死んだ細胞をマークします。
生/死染色に続いて、CSMで洗浄した培地で細胞をクエンチした後、25マイクロリットルの16%パラホルムアルデヒドで細胞を固定しました。室温で10分間インキュベートした後、遠心分離により細胞を回収する。5〜15ミリリットルのCSMを加え、再び遠心分離します。
10%ジメチルスルホキシドを添加した500マイクロリットルの細胞染色培地にペレットを再懸濁します。次に、細胞をより小さなチューブに移して、摂氏マイナス80度で保管します。細胞周期解析のためにを正規化するには、ファイルを適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアプログラムにインポートし、191イリジウムに対するイベント長の二軸プロットを作成します。
細胞は、明瞭な明るいイリジウム高集団を形成するであろう。イベントの長さのスケールを変更して、セルがより目立つようにします。次に、ダブレットとデブリの50〜60%を除外するシングレットゲートを作成し、残りのダブレットとデブリを除去するために残差とオフセットガウスパラメータを設定します。
S相ゲートを設定するには、IdU対拡散マーカーの二軸プロットを作成します。S期IdU陽性細胞は別個の集団を形成する。G0/G1およびG2/Mゲーティングの場合、IdU対サイクリンB1プロットでゲートを確立します。
G0 / G1フェーズはサイクリンB1ロー、IdU陰性、G2 / MフェーズはサイクリンB1ハイ、IdU陰性になります。特定の細胞タイプをゲートするには、サイクリンB1対IdUグラフにS期細胞のみをプロットして、G0/G1期細胞とG2/M期細胞の分離を確立します。サイクリンB1の人口が多い場所の周りにゲートを引きます。
場合によっては、これを識別するのが難しい場合がありますが、S期集団の約上位5%のサイクリンB1のレベルは、通常、G0 / G1とG2 / M相ゲートの間のブレークポイントです。前のゲート内に存在するセルはG2/M相集団となり、残りはG0/G1期集団になります。G0期集団を確立するには、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質対IdUプロットを作成します。
G0期は、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質低、IdU陰性集団によって表されるであろう。活発なサイクリング集団は、高いリン酸化網膜芽細胞腫タンパク質とIdUの取り込みを示すため、G0フェーズゲートは、通常、2つの異なる集団で発現するため、この境界に描画できます。G0ゲートの定義が困難な場合は、S期集団を活性集団とし、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質の上位90〜100%を組み込んだゲートを描画します。
ゲート外のリン酸化網膜芽細胞腫タンパク質の低集団は通常G0集団であり、このゲートに入るpRbレベルのG0 / G1細胞はG1細胞です。M相ゲーティングの場合、軸方向プロットによってIdU対リン酸化ヒストンH3を作成します。M期は、リン酸化ヒストンH3集団内の細胞のごく一部として観察されます。
pHH3のレベルが低いG2 / M集団の細胞はG2細胞です。IdUの取り込みに失敗した場合、または不可能であった場合は、Ki67およびリン酸化網膜芽細胞腫タンパク質を使用して、サイクリングおよびサイクリングではない細胞画分を定義します。二重陽性の母集団は、G1、S、G2、およびMフェーズに相関するアクティブなサイクリング集団を表します。
二重低母集団は、G0フェーズと相関する循環しない人口を表します。すべてのゲートが確立されたら、ゲートから数値をエクスポートします。各サイクルのパーセンテージは、結合された集団から単一の集団を差し引いて、後続のグラフ作成および統計分析のために個々の細胞周期フェーズの数値を生成することによって達成できます。
一重項ゲートの確立は、細胞残骸およびダブレットを分離して単一細胞集団の単離を可能にするために重要である。次いで、単一細胞の細胞周期解析を行うことができる。IdU標識、したがって下流の細胞周期分析は、時間と温度によって大きく影響を受ける可能性があります。
例えば、密閉された容器内または場所間の輸送中に長すぎる細胞は、S期画分が減少し、細胞周期分析には正確ではありません。1時間以下の短期間保持された細胞サンプルは、依然として正常な細胞周期分布を示しており、迅速な輸送が分析に悪影響を及ぼさない可能性があることを示しています。凍結保存された細胞は、細胞が活性細胞サイクルに戻るまでに長い平衡化期間を必要とする場合があり、これは依然として凍結保存前の細胞周期状態を反映していない可能性があります。
異なる細胞タイプも、維持条件によって異なる影響を受ける可能性があります。例えば、このヒト骨髄サンプルでは、T細胞は同じサンプルからの単芽細胞と比較して細胞数の減少を示した。マスサイトメトリーのもう一つの利点は、細胞周期停止中の細胞や異常な細胞周期分布を有する細胞を識別できることです。
この技術の主な利点は、表面表現型、クロマチン構造、細胞内サイトカイン刺激などの他の質量サイトメトリー測定と容易に互換性があり、細胞周期状態と相関させることができることである。この手法を使用して、免疫細胞の枯渇、老化を研究し、急性白血病患者の化学療法に対する反応が白血病細胞の細胞周期特性と相関する可能性があることを示しました。
