이 프로토콜을 통해 질량 세포계를 사용하여 단일 세포 수준에서 세포 주기를 검사할 수 있으며, 이를 통해 여러 가지 새로운 연구 및 임상 연구를 수행할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단순성입니다. IdU는 세포에 직접 첨가되며 추가 치료 또는 항체가 필요하지 않습니다.
우리는 이 기술을 사용하여 줄기 및 전구 세포 구획 내에서 급성 골수성 백혈병 환자의 세포 주기 상태를 조사했습니다. 그리고 이것은 이러한 특정 세포 유형의 세포주기 특성이 이러한 질병을 가진 환자의 임상 결과와 상관 관계가 있음을 입증했습니다. 이 기술은 희귀 암세포의 성장 특성을 이해하고 면역 세포 하위 집합의 증식을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.
IdU를 세포 샘플에 첨가하기 전과 후에, 세포를 관심있는 성장 조건으로 유지시킨다. 이때, 섭씨 37도의 가습 배양기에서 세포를 IdU로 표지하기 위해 5%CO2, 농축된 IdU 원액을 1 내지 50으로 희석하여 세포의 성장 배지로 희석한다. 그런 다음 샘플을 생물 안전 후드로 옮기고 세포 1 밀리리터마다 1 밀리몰 IdU 10 마이크로 리터를 추가합니다.
샘플을 개별 원추형 튜브로 옮기기 전에 세포를 10-15분 동안 인큐베이터로 되돌립니다. 15 밀리리터 원뿔형 튜브에서 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 튜브 당 200 마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁시킨다. 필요한 경우 죽은 세포를 표시하기 위해 적절한 살아있는/죽은 얼룩으로 세포에 라벨을 붙입니다.
살아있는/죽은 염색 후, 세포를 25마이크로리터의 16% 파라포름알데히드로 고정하기 전에 CSM으로 세척된 배지로 세포를 담금질했습니다. 실온에서 10분간 배양한 후, 원심분리를 통해 세포를 수집한다. 5 내지 15 밀리리터의 CSM을 첨가하고 다시 원심 분리한다.
10%디메틸 설폭사이드가 보충된 500마이크로리터의 세포 염색 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 더 작은 튜브로 옮겨 섭씨 영하 80도에 보관합니다. 세포 주기 분석을 위해 정규화하려면 파일을 적절한 유세포 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 이벤트 길이 대 191 이리듐의 이축 플롯을 만듭니다.
세포는 뚜렷한 밝은 이리듐 높은 집단을 형성합니다. 셀이 더 두드러지게 나타나도록 이벤트 길이 배율을 변경합니다. 그런 다음 이중선과 파편의 50-60%를 제외하는 싱글렛 게이트를 만들고 잔차 및 오프셋 가우스 매개변수를 설정하여 남아 있는 이중선과 파편을 제거합니다.
S상 게이트를 설정하려면 IdU 대 증식 마커의 이축 플롯을 만듭니다. S상 IdU 양성 세포는 별개의 집단을 형성합니다. G0/G1 및 G2/M 게이팅의 경우 IdU 대 Cyclin B1 플롯에 게이트를 설정합니다.
G0/G1 단계는 사이클린 B1 낮음, IdU 음성, G2/M 단계는 사이클린 B1 높음, IdU 음성입니다. 특정 세포 유형을 게이트하려면 G0/G1 상과 G2/M 상 세포 간의 분리를 설정하는 데 도움이 되도록 Cyclin B1 대 IdU 그래프에 S상 세포만 표시합니다. Cyclin B1 인구가 많은 주위에 게이트를 그립니다.
어떤 경우에는 식별하기 어려울 수 있지만 S상 모집단의 약 상위 5%의 사이클린 B1 수준은 일반적으로 G0/G1과 G2/M 위상 게이트 사이의 중단점입니다. 이전 게이트 내에 있는 세포는 G2/M 위상 집단이 되고 나머지는 G0/G1 위상 집단이 됩니다. G0기 모집단을 설정하려면 인산화된 망막모세포종 단백질 대 IdU 플롯을 만듭니다.
G0 단계는 인산화된 망막모세포종 단백질이 낮고 IdU 음성 집단으로 표시됩니다. 활성 사이클링 집단이 높은 인산화된 망막모세포종 단백질 및 IdU 결합을 입증할 것이기 때문에, G0 위상 게이트는 일반적으로 두 개의 별개의 집단에서 발현되기 때문에 이 경계에서 그릴 수 있습니다. G0 게이트를 정의하기 어려운 경우 S상 모집단을 활성 모집단으로 만들고 인산화된 망막모세포종 단백질 고모집단의 상위 90-100%를 포함하는 게이트를 그립니다.
게이트 외부의 인산화된 망막모세포종 단백질 낮은 집단은 일반적으로 G0 집단인 반면, 이 게이트에 속하는 pRb 수준을 갖는 G0/G1 세포는 G1 세포입니다. M상 게이팅의 경우 축 플롯으로 IdU 대 인산화된 히스톤 H3를 생성합니다. M상 단계는 인산화된 히스톤 H3 집단 내에서 세포의 매우 작은 부분으로 관찰됩니다.
pHH3 수치가 낮은 G2/M 집단의 세포가 G2 세포입니다. IdU 통합이 실패했거나 불가능한 경우 Ki67 및 인산화된 망막모세포종 단백질을 사용하여 사이클링 및 사이클링이 아닌 세포 분획을 정의합니다. 이중 양성 모집단은 G1, S, G2 및 M-단계와 상관관계가 있는 활성 순환 모집단을 나타냅니다.
이중 낮은 인구는 G0 단계와 상관 관계가 있는 순환하지 않는 인구를 나타냅니다. 모든 게이트가 설정되면 게이트에서 숫자 값을 내보냅니다. 각 주기의 백분율은 결합된 모집단에서 단일 모집단을 빼서 후속 그래프 작성 및 통계 분석을 위해 각 개별 세포 주기 단계에 대한 수치를 생성함으로써 달성할 수 있습니다.
단일항 게이트의 확립은 단세포 집단의 분리를 허용하기 위해 세포 파편과 이중선을 분리하는 데 중요합니다. 이어서, 단일세포의 세포 주기 분석이 수행될 수 있다. IdU 라벨링 및 이에 따른 다운스트림 세포 주기 분석은 시간과 온도에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다.
예를 들어, 밀폐된 용기 또는 위치 간 운송에 너무 오래 남아 있는 세포는 S상 분획이 감소하여 세포 주기 분석에 정확하지 않습니다. 한 시간 이하의 짧은 기간 동안 보관된 세포 샘플은 여전히 정상적인 세포 주기 분포를 보여주며, 이는 빠른 수송이 분석에 부정적인 영향을 미치지 않을 수 있음을 나타냅니다. 냉동보존된 세포는 세포가 활성 세포 사이클링으로 복귀하기 전에 긴 평형 기간을 필요로 할 수 있으며, 이는 여전히 동결보존 전 세포 주기 상태를 반영하지 않을 수 있습니다.
다른 세포 유형은 또한 유지 조건에 의해 차별적으로 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어, 이 인간 골수 샘플에서 T 세포는 동일한 샘플의 단모세포에 비해 세포 수의 감소를 입증했습니다. 질량 세포 분석의 또 다른 이점은 세포 주기 정지 또는 비정상적인 세포 주기 분포를 가진 세포를 구별할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 주요 장점은 표면 표현형, 염색질 구조, 세포내 사이토카인 자극과 같은 다른 질량 세포 분석 측정과 쉽게 호환되며, 이는 세포 주기 상태와 상관될 수 있다는 것입니다. 우리는 이 기술을 사용하여 면역 세포 고갈, 노화를 연구하고 급성 백혈병 환자의 화학 요법에 대한 반응이 백혈병 세포의 세포 주기 특성과 상관관계가 있을 수 있음을 보여주었습니다.
