该协议使我们能够使用质谱细胞仪在单细胞水平上检查细胞周期，这使得可以进行几项新的研究和临床研究。这种技术的主要优点是它的简单性。IdU直接添加到细胞中，无需进一步处理或抗体。
我们已经使用这种技术来研究干细胞和祖细胞区室内急性髓系白血病患者的细胞周期状态。这表明这些特定细胞类型的细胞周期特性可能与这些疾病患者的临床结果相关。该技术可用于了解稀有癌细胞的生长特性和了解免疫细胞亚群的增殖。
在将IdU添加到细胞样品之前和之后，将细胞保持在感兴趣的生长条件下。在这种情况下，在5%CO 2的37摄氏度加湿培养箱中用IdU标记细胞，将浓缩的IdU储备溶液稀释到细胞的生长培养基中。然后将样品转移到生物安全罩中，并向每1毫升细胞中加入10微升一毫摩尔IdU。
将细胞放回培养箱中10至15分钟，然后将样品转移到单独的锥形管中。通过在15毫升锥形管中离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管200微升PBS中。如果需要，用适当的活/死染色标记细胞以标记死细胞。
活/死染色后，用CSM洗涤的培养基淬灭细胞，然后用25微升16%多聚甲醛固定细胞。在室温下孵育10分钟后，通过离心收集细胞。加入5至15毫升CSM，再次离心。
将沉淀重悬于补充有10%二甲基亚砜的500微升细胞染色培养基中。然后将细胞转移到较小的管中，将它们储存在负80摄氏度下。要标准化其细胞周期分析，请将文件导入适当的流式细胞术分析软件程序，并创建事件长度与191铱的双轴图。
这些细胞将形成一个独特的明亮铱高群体。更改事件长度刻度以使单元格显示得更突出。然后创建一个单重门以排除 50% 到 60% 的双峰和碎片，并设置残余和高斯偏移参数以去除任何剩余的双峰和碎片。
要设置 S 相门，请创建 IdU 与增殖标记的双轴图。S期IdU阳性细胞将形成一个独特的群体。对于 G0/G1 和 G2/M 门控，在 IdU 与细胞周期蛋白 B1 图上建立门。
G0/G1 期将为细胞周期蛋白 B1 低，IdU 阴性，G2/M 期将为细胞周期蛋白 B1 高，IdU 阴性。要针对特定细胞类型进行门控，请仅在细胞周期蛋白 B1 与 IdU 图上绘制 S 期细胞，以帮助确定 G0/G1 期和 G2/M 期细胞之间的分离。在细胞周期蛋白B1高种群周围画一个门。
在某些情况下，这可能很难辨别，但细胞周期蛋白B1的水平约为S相群体的前5%，通常是G0/G1和G2/M相栅极之间的断点。驻留在前一个门内的细胞将是G2 / M相群体，而其余的将是G0 / G1相群体。要建立 G0 期群体，请创建磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白与 IdU 图。
G0期将由磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白低，IdU阴性群体表示。由于活跃的循环群体将表现出高磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白和IdU掺入，因此G0相门可以在此边界上绘制，因为它通常在两个不同的群体中表达。如果 G0 门难以定义，请将 S 期群体设置为活跃群体，并绘制包含前 90% 至 100% 磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白高群体的门。
门外的磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白低群体通常是G0群体，而落在该门中的pRb水平的G0 / G1细胞是G1细胞。对于 M 期门控，通过轴向图创建 IdU 与磷酸化组蛋白 H3。M相将作为磷酸化组蛋白H3群体中非常小的细胞部分被观察到。
G2/M 群体中 pHH3 水平较低的细胞是 G2 细胞。如果 IdU 掺入失败或不可能，请使用 Ki67 和磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白定义循环和非循环细胞组分。双正总体将表示与 G1、S、G2 和 M 阶段相关的活跃循环总体。
双低人口将表示与 G0 阶段相关的非循环人口。建立所有门后，从门导出数值。每个周期中的百分比可以通过从组合群体中减去单个群体来实现，以生成每个单独细胞周期阶段的数值，以便随后进行图形和统计分析。
单线态门的建立对于分离细胞碎片和双峰以允许分离单细胞群非常重要。然后可以对单个细胞进行细胞周期分析。IdU标记和下游细胞周期分析会受到时间和温度的显着影响。
例如，在封闭容器中或在位置之间运输中停留时间过长的细胞将具有减少的S相分数，这对于细胞周期分析将不准确。细胞样品保持一小时或更短的时间仍然显示出正常的细胞周期分布，表明快速运输可能不会对分析产生负面影响。冷冻保存的细胞可能需要很长的平衡期才能使细胞恢复到活跃的细胞周期，这可能仍然不能反映冷冻保存前的细胞周期状态。
不同的细胞类型也可能受到维持条件的差异影响。例如，在这个人类骨髓样本中，与来自同一样本的单母细胞相比，T细胞显示出细胞数量的减少。质谱细胞术的另一个好处是能够区分细胞周期停滞或细胞周期分布异常的细胞。
该技术的一个主要优点是它很容易与其他质谱细胞术测量兼容，例如表面表型，染色质结构，细胞内细胞因子刺激，这些都可以与细胞周期状态相关。我们已经使用这种技术来研究免疫细胞的衰竭，衰老，并表明急性白血病患者对化疗的反应可能与白血病细胞的细胞周期特性相关。
