Dieses Protokoll ermöglicht es uns, den Zellzyklus auf Einzelzellebene mit dem Massenzytometer zu untersuchen, was die Durchführung mehrerer neuartiger Forschungs- und klinischer Studien ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit. IdU wird direkt in die Zellen gegeben und es sind keine weiteren Behandlungen oder Antikörper erforderlich.
Wir haben diese Technik verwendet, um den Zellzykluszustand bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie innerhalb der Stamm- und Vorläuferzellkompartimente zu untersuchen. Und dies zeigte, dass die Zellzykluseigenschaften dieser spezifischen Zelltypen mit dem klinischen Ergebnis von Patienten mit diesen Krankheiten korrelieren können. Diese Technik kann nützlich sein, um die Wachstumseigenschaften seltener Krebszellen zu verstehen und die Proliferation von Immunzelluntergruppen zu verstehen.
Halten Sie die Zellen vor und nach der Zugabe von IdU zu den Zellproben in den gewünschten Wachstumsbedingungen. In diesem Fall wird ein befeuchteter 37 Grad Celsius Inkubator bei 5%CO2 zur Markierung der Zellen mit IdU die konzentrierte IdU-Stammlösung eins zu 50 in die Wachstumsmedien der Zellen verdünnt. Anschließend werden die Proben in eine Biosicherheitshaube überführt und auf jeden Milliliter Zellen 10 Mikroliter eines millimolaren IdU gegeben.
Bringen Sie die Zellen für 10 bis 15 Minuten in den Inkubator zurück, bevor Sie die Proben in einzelne konische Röhrchen überführen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in konischen 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS pro Röhrchen. Beschriften Sie die Zellen bei Bedarf mit einer geeigneten lebenden/toten Färbung, um die toten Zellen zu markieren.
Nach der Lebend-/Totfärbung wurden die Zellen mit mit CSM gewaschenem Medium abgeschreckt, bevor die Zellen mit 25 Mikrolitern 16%igem Paraformaldehyd fixiert wurden. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Fügen Sie fünf bis 15 Milliliter CSM hinzu und zentrifugieren Sie erneut.
Resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern Zellfärbemedium, das mit 10 % Dimethylsulfoxid angereichert ist. Anschließend werden die Zellen in kleinere Röhrchen überführt, um sie bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Um die für ihre Zellzyklusanalyse zu normalisieren, importieren Sie die Dateien in ein geeignetes Durchflusszytometrie-Analyseprogramm und erstellen Sie ein biaxiales Diagramm der Ereignislänge im Vergleich zu 191 Iridium.
Die Zellen bilden eine ausgeprägte, helle Iridium-Population. Ändern Sie die Längenskala des Ereignisses, damit die Zellen hervorgehoben werden. Erstellen Sie dann ein Singulett-Gatter, um 50 bis 60 % der Dubletten und Trümmer auszuschließen, und legen Sie die Residuen- und Offset-Gauß-Parameter fest, um alle verbleibenden Dubletten und Rückstände zu entfernen.
Um das S-Phasen-Gatter festzulegen, erstellen Sie ein biaxiales Diagramm von IdU im Vergleich zu einem Proliferationsmarker. Die S-Phase IdU-positiven Zellen bilden eine eigene Population. Legen Sie für G0/G1- und G2/M-Gating die Gates in einem IdU- und Cyclin B1-Diagramm fest.
Die G0/G1-Phase ist Cyclin B1-niedrig, IdU-negativ, und die G2/M-Phase ist Cyclin B1-hoch, IdU-negativ. Um bestimmte Zelltypen zu ermitteln, zeichnen Sie nur die S-Phasen-Zellen im Cyclin B1- und IdU-Diagramm auf, um die Trennung zwischen G0/G1-Phasen- und G2/M-Phasenzellen zu ermitteln. Zeichne ein Tor um die hohe Population von Cyclin B1.
In einigen Fällen kann dies schwer zu erkennen sein, aber der Cyclin-B1-Spiegel von etwa den oberen 5 % der S-Phasen-Population ist typischerweise der Bruchpunkt zwischen den G0/G1- und G2/M-Phasengattern. Die Zellen, die sich innerhalb des vorherigen Tors befinden, sind die G2/M-Phasenpopulation, während der Rest die G0/G1-Phasenpopulation ist. Um die G0-Phasenpopulation zu bestimmen, erstellen Sie ein phosphoryliertes Retinoblastom-Protein im Vergleich zum IdU-Diagramm.
Die G0-Phase wird durch eine phosphorylierte Retinoblastom-Protein-niedrige, IdU-negative Population repräsentiert. Da die aktiv zyklische Population ein hochphosphoryliertes Retinoblastom-Protein und eine IdU-Inkorporation aufweist, kann das G0-Phasengatter an dieser Grenze gezeichnet werden, da es typischerweise in zwei verschiedenen Populationen exprimiert wird. Wenn das G0-Gate schwer zu definieren ist, machen Sie die S-Phasen-Population zur aktiven Population und zeichnen Sie ein Gate, das die obersten 90 bis 100 % der phosphorylierten Retinoblastom-Protein-High-Population enthält.
Die phosphorylierte Retinoblastom-Protein-Low-Population außerhalb des Gate-Bereichs ist typischerweise die G0-Population, während die G0/G1-Zellen mit pRb-Spiegeln, die in dieses Gate fallen, G1-Zellen sind. Für das M-Phasen-Gating wird ein IdU versus phosphoryliertes Histon H3 durch axiales Diagramm erstellt. Die M-Phasenphase wird als der sehr kleine Anteil der Zellen innerhalb der phosphorylierten Histon-H3-Population betrachtet.
Die Zellen in der G2/M-Population mit niedrigeren pHH3-Spiegeln sind die G2-Zellen. Wenn die IdU-Inkorporation fehlgeschlagen ist oder nicht möglich war, definieren Sie die zyklischen und nicht zyklischen Zellfraktionen unter Verwendung von Ki67 und phosphoryliertem Retinoblastomprotein. Die doppelt positive Population repräsentiert die aktiv radelnde Population, die mit den Phasen G1, S, G2 und M korreliert.
Die doppelt niedrige Population repräsentiert die nicht radelnde Population, die mit der G0-Phase korreliert. Wenn alle Gatter eingerichtet sind, exportieren Sie die numerischen Werte aus den Gattern. Die Prozentsätze in jedem Zyklus können erreicht werden, indem die einzelnen Populationen von den kombinierten Populationen subtrahiert werden, um numerische Werte für jede einzelne Zellzyklusphase für die anschließende grafische Darstellung und statistische Analyse zu generieren.
Die Etablierung des Singulett-Gatters ist wichtig für die Trennung der zellulären Trümmer und Dubletten, um die Isolierung der Einzelzellpopulation zu ermöglichen. Anschließend kann eine Zellzyklusanalyse der einzelnen Zellen durchgeführt werden. Die IdU-Markierung und damit die nachgelagerte Zellzyklusanalyse kann erheblich von Zeit und Temperatur beeinflusst werden.
Zum Beispiel haben Zellen, die zu lange in geschlossenen Gefäßen oder beim Transport zwischen den Orten verbleiben, reduzierte S-Phasen-Anteile, was für die Zellzyklusanalyse nicht genau ist. Zellproben, die für kurze Zeiträume von einer Stunde oder weniger aufbewahrt werden, zeigen immer noch eine normale Zellzyklusverteilung, was darauf hindeutet, dass ein schneller Transport die Analyse möglicherweise nicht negativ beeinflusst. Kryokonservierte Zellen benötigen möglicherweise eine lange Äquilibrierungsphase, bevor die Zellen in den aktiven Zellzyklus zurückkehren, was möglicherweise immer noch nicht den Zustand des Zellzyklus vor der Kryokonservierung widerspiegelt.
Verschiedene Zelltypen können auch durch die Aufrechterhaltungsbedingungen unterschiedlich beeinflusst werden. In dieser menschlichen Knochenmarkprobe zeigten die T-Zellen beispielsweise eine Verringerung der Zellzahl im Vergleich zu Monoblasten aus derselben Probe. Ein weiterer Vorteil der Massenzytometrie ist die Fähigkeit, Zellen zu unterscheiden, die sich im Zellzyklusarrest befinden oder eine abnormale Zellzyklusverteilung aufweisen.
Ein großer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht mit anderen Massenzytometriemessungen kompatibel ist, wie z. B. Oberflächenphänotypisierung, Chromatinstruktur, intrazellulärer Zytokinstimulation, die mit dem Zellzykluszustand korreliert werden können. Wir haben diese Technik verwendet, um die Erschöpfung und Seneszenz von Immunzellen zu untersuchen und zu zeigen, dass das Ansprechen auf eine Chemotherapie bei Patienten mit akuter Leukämie mit den Zellzykluseigenschaften der Leukämiezellen korrelieren kann.
