Questo protocollo ci consente di esaminare il ciclo cellulare a livello di singola cellula utilizzando il citometro di massa, e questo consente di eseguire diverse nuove ricerche e studi clinici. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità. L'IDU viene aggiunta direttamente alle cellule e non sono necessari ulteriori trattamenti o anticorpi.
Abbiamo usato questa tecnica per studiare lo stato del ciclo cellulare in pazienti con leucemia mieloide acuta all'interno dei compartimenti delle cellule staminali e progenitrici. E questo ha dimostrato che le proprietà del ciclo cellulare di questi specifici tipi di cellule possono essere correlate con l'esito clinico dei pazienti con queste malattie. Questa tecnica può essere utile per comprendere le proprietà di crescita delle cellule tumorali rare e comprendere la proliferazione dei sottogruppi di cellule immunitarie.
Prima e dopo aver aggiunto IdU ai campioni cellulari, mantenere le cellule nelle condizioni di crescita di interesse. In questo caso, un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius al 5% di CO2 per etichettare le cellule con IdU, diluire la soluzione madre concentrata di IdU da uno a 50 nei mezzi di crescita delle cellule. Quindi trasferire i campioni in una cappa di biosicurezza e aggiungere 10 microlitri di un millimolare IdU a ogni millilitro di cellule.
Restituire le cellule all'incubatore per 10-15 minuti prima di trasferire i campioni ai singoli tubi conici. Raccogliere le celle mediante centrifugazione in tubi conici da 15 millilitri e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS per tubo. Se necessario, etichettare le celle con una macchia viva / morta appropriata per contrassegnare le cellule morte.
Dopo la colorazione viva / morta, spegnere le cellule con mezzi lavati con CSM prima di fissare le cellule con 25 microlitri di paraformaldeide al 16%. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Aggiungere da cinque a 15 millilitri di CSM e centrifugare nuovamente.
Risospendere i pellet in 500 microlitri di mezzo di colorazione cellulare integrato con il 10% di dimetilsolfossido. Quindi trasferire le cellule in tubi più piccoli per memorizzarle in 80 gradi Celsius negativi. Per normalizzare l'analisi del ciclo cellulare, importare i file in un programma software di analisi della citometria a flusso appropriato e creare un grafico biassiale della lunghezza dell'evento rispetto a 191 iridio.
Le cellule formeranno una distinta popolazione luminosa di iridio. Modificate la scala della lunghezza dell'evento per rendere le celle più prominenti. Quindi creare un cancello di singoletto per escludere dal 50 al 60% dei doppietti e dei detriti e impostare i parametri gaussiani residui e sfalsati per rimuovere eventuali doppietti e detriti rimanenti.
Per impostare il gate di fase S, creare un grafico biassiale di IdU rispetto a un marcatore di proliferazione. Le cellule IdU positive in fase S formeranno una popolazione distinta. Per G0/G1 e G2/M gating, stabilire le porte su un grafico IdU rispetto a Cyclin B1.
La fase G0/G1 sarà Cyclin B1 bassa, IdU negativa, e la fase G2/M sarà Cyclin B1 alta, IdU negativa. Per individuare tipi di cellule specifici, tracciare solo le celle della fase S sul grafico Cyclin B1 rispetto a IdU per aiutare a stabilire la separazione tra le celle di fase G0 / G1 e G2 / M. Disegna un cancello intorno all'alta popolazione di Cyclin B1.
In alcuni casi, questo può essere difficile da discernere, ma il livello di ciclina B1 di circa il 5% superiore della popolazione in fase S è tipicamente il punto di rottura tra le porte di fase G0 / G1 e G2 / M. Le cellule che risiedono all'interno del gate precedente saranno la popolazione di fase G2/M, mentre il resto sarà la popolazione di fase G0/G1. Per stabilire la popolazione della fase G0, creare una proteina del retinoblastoma fosforilato rispetto al grafico IdU.
La fase G0 sarà rappresentata da una proteina fosforilata del retinoblastoma a bassa popolazione, IdU negativa. Poiché la popolazione ciclica attiva dimostrerà un'elevata proteina di retinoblastoma fosforilato e l'incorporazione di IdU, la porta di fase G0 può essere disegnata su questo confine in quanto si esprime tipicamente in due popolazioni distinte. Se il gate G0 è difficile da definire, rendere la popolazione in fase S la popolazione attiva e disegnare un gate che incorpori il 90-100% superiore della popolazione ad alta proteina del retinoblastoma fosforilato.
La bassa popolazione della proteina retinoblastoma fosforilata al di fuori del gate è tipicamente la popolazione G0, mentre le cellule G0 / G1 con livelli di pRb che cadono in questa porta sono cellule G1. Per il gating in fase M, creare un IdU rispetto all'istone fosforilato H3 mediante tracciatura assiale. La fase di fase M sarà osservata come la frazione molto piccola di cellule all'interno della popolazione di istoni fosforilati H3.
Le cellule nella popolazione G2/M con livelli più bassi di pHH3 sono le cellule G2. Se l'incorporazione di IdU non è riuscita o non è stata possibile, definire le frazioni cellulari cicliche e non cicliche utilizzando Ki67 e la proteina del retinoblastoma fosforilato. La popolazione doppia positiva rappresenterà la popolazione ciclica attiva correlata alle fasi G1, S, G2 e M.
La popolazione doppia bassa rappresenterà la popolazione non ciclica correlata alla fase G0. Una volta stabilite tutte le porte, esportare i valori numerici dalle porte. Le percentuali in ogni ciclo possono essere ottenute sottraendo le singole popolazioni dalle popolazioni combinate per generare valori numerici per ogni singola fase del ciclo cellulare per la successiva rappresentazione grafica e analisi statistica.
L'istituzione della porta singoletto è importante per separare i detriti cellulari e i doppietti per consentire l'isolamento della popolazione monocellulare. È quindi possibile eseguire l'analisi del ciclo cellulare delle singole cellule. L'etichettatura IDU e quindi l'analisi del ciclo cellulare a valle possono essere influenzate in modo significativo dal tempo e dalla temperatura.
Ad esempio, le cellule che rimangono troppo a lungo in vasi chiusi o nel trasporto tra le posizioni avranno frazioni di fase S ridotte e ciò non sarà accurato per l'analisi del ciclo cellulare. I campioni di cellule conservati per brevi periodi di un'ora o meno dimostrano ancora una normale distribuzione del ciclo cellulare, indicando che un trasporto rapido potrebbe non avere un impatto negativo sull'analisi. Le cellule crioconservate possono richiedere un lungo periodo di equilibrio prima che le cellule ritornino al ciclo cellulare attivo, che potrebbe ancora non riflettere lo stato del ciclo cellulare di pre-crioconservazione.
Diversi tipi di cellule possono anche essere influenzati in modo differenziale dalle condizioni di mantenimento. Ad esempio, in questo campione di midollo osseo umano, le cellule T hanno dimostrato una riduzione del numero di cellule rispetto ai monoblasti dello stesso campione. Un altro vantaggio della citometria di massa è la capacità di discriminare le cellule nell'arresto del ciclo cellulare o che hanno una distribuzione anormale del ciclo cellulare.
Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che è facilmente compatibile con altre misurazioni della citometria di massa come la fenotipizzazione superficiale, la struttura della cromatina, lo stimolo delle citochine intracellulari, che può essere correlato con lo stato del ciclo cellulare. Abbiamo usato questa tecnica per studiare l'esaurimento delle cellule immunitarie, la senescenza e per dimostrare che la risposta alla chemioterapia nei pazienti con leucemia acuta può essere correlata con le proprietà del ciclo cellulare delle cellule leucemiche.
