Este protocolo nos permite examinar o ciclo celular em nível de célula única usando o citômetro de massa, e isso permite que várias pesquisas e estudos clínicos novos sejam realizados. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade. IdU é adicionado diretamente às células e não há necessidade de tratamento adicional ou anticorpos.
Usamos essa técnica para investigar o estado do ciclo celular em pacientes com leucemia mieloide aguda dentro dos compartimentos das células-tronco e progenitoras. E isso demonstrou que as propriedades do ciclo celular desses tipos celulares específicos podem se correlacionar com o desfecho clínico de pacientes com essas doenças. Esta técnica pode ser útil para compreender as propriedades de crescimento de células cancerosas raras e compreender a proliferação de subgrupos de células imunes.
Antes e depois de adicionar IdU às amostras celulares, manter as células nas condições de crescimento de interesse. Neste caso, uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius a 5% de CO2 para marcar as células com IdU, dilui a solução estoque de IdU concentrada de um a 50 no meio de crescimento das células. Em seguida, transfira as amostras para uma coifa de biossegurança e adicione 10 microlitros de IdU milimolar a cada mililitro de células.
Retornar as células à incubadora por 10 a 15 minutos antes de transferir as amostras para tubos cônicos individuais. Coletar as células por centrifugação em tubos cônicos de 15 mililitros e ressuspender os pellets em 200 microlitros de PBS por tubo. Se necessário, rotule as células com uma coloração viva/morta apropriada para marcar as células mortas.
Após coloração viva/morta, as células foram extintas com meio lavado com MSC antes de fixar as células com 25 microlitros de paraformaldeído a 16%. Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, coletar as células por centrifugação. Adicione de cinco a 15 mililitros de CSM e centrífuga novamente.
Ressuspender os pellets em 500 microlitros de meio corante celular suplementado com 10% de dimetilsulfóxido. Em seguida, transfira as células para tubos menores para armazená-las em 80 graus Celsius negativos. Para normalizar a análise do ciclo celular, importe os arquivos para um programa de software de análise de citometria de fluxo apropriado e crie um gráfico biaxial do comprimento do evento versus 191 irídio.
As células formarão uma população distinta de irídio brilhante alto. Altere a escala de comprimento do evento para que as células pareçam mais proeminentes. Em seguida, crie um portão singlet para excluir 50 a 60% dos duplos e detritos e defina os parâmetros gaussianos residuais e deslocados para remover quaisquer duplos e detritos restantes.
Para definir a porta da fase S, crie um gráfico biaxial de IdU versus um marcador de proliferação. As células IdU positivas em fase S formarão uma população distinta. Para G0/G1 e G2/M, estabeleça os portões em um gráfico IdU versus Cyclin B1.
A fase G0/G1 será Ciclina B1 baixa, IdU negativa, e a fase G2/M será Ciclina B1 alta, IdU negativa. Para atender a tipos de células específicos, plote apenas as células de fase S no gráfico de ciclina B1 versus IdU para ajudar a estabelecer a separação entre as células de fase G0/G1 e as células de fase G2/M. Desenhe um portão em torno da alta população da ciclina B1.
Em alguns casos, isso pode ser difícil de discernir, mas o nível de ciclina B1 de aproximadamente 5% da população da fase S é tipicamente o ponto de interrupção entre as portas de fase G0/G1 e G2/M. As células residentes dentro do portão anterior serão a população da fase G2/M, enquanto o restante será a população da fase G0/G1. Para estabelecer a população da fase G0, crie uma proteína de retinoblastoma fosforilada versus gráfico de IdU.
A fase G0 será representada por uma população de baixa proteína de retinoblastoma fosforilada, IdU negativa. Como a população cicladora ativa demonstrará uma alta incorporação de proteína de retinoblastoma fosforilada e IdU, a porta de fase G0 pode ser desenhada neste limite, pois tipicamente se expressa em duas populações distintas. Se o portão G0 for difícil de definir, faça da população da fase S a população ativa e desenhe um portão incorporando os 90 a 100% superiores da proteína de retinoblastoma fosforilado alta população.
A baixa população da proteína fosforilada do retinoblastoma fora do portão é tipicamente a população G0, enquanto as células G0/G1 com níveis de pRb que caem nesse portão são células G1. Para gating de fase M, crie um IdU versus histona fosforilada H3 por gráfico axial. A fase M será observada como a fração muito pequena de células dentro da população de histona H3 fosforilada.
As células da população G2/M com menores níveis de pHH3 são as células G2. Se a incorporação de IdU falhou ou não foi possível, defina a ciclagem e não ciclagem das frações celulares usando Ki67 e proteína retinoblastoma fosforilada. A população duplamente positiva representará a população ciclável ativa correlacionando-se com as fases G1, S, G2 e M.
A dupla população baixa representará a população não ciclável correlacionando-se com a fase G0. Uma vez que todos os portões tenham sido estabelecidos, exporte os valores numéricos dos portões. As porcentagens em cada ciclo podem ser obtidas subtraindo-se as populações individuais das populações combinadas para gerar valores numéricos para cada fase do ciclo celular individual para posterior análise gráfica e estatística.
O estabelecimento da porta singlete é importante para separar os debris celulares e duplos para permitir o isolamento da população unicelular. A análise do ciclo celular das células individuais pode então ser realizada. A marcação de IdU e, portanto, a análise do ciclo celular a jusante podem ser significativamente afetadas pelo tempo e temperatura.
Por exemplo, células que permanecem muito tempo em vasos fechados ou em transporte entre locais terão frações de fase S reduzidas e isso não será preciso para a análise do ciclo celular. Amostras celulares mantidas por curtos períodos de uma hora ou menos ainda demonstram uma distribuição normal do ciclo celular, indicando que um transporte rápido pode não impactar negativamente a análise. As células criopreservadas podem requerer um longo período de equilíbrio antes que as células retornem à ciclagem celular ativa, o que ainda pode não refletir o estado do ciclo celular pré-criopreservação.
Diferentes tipos celulares também podem ser afetados diferencialmente pelas condições de manutenção. Por exemplo, nesta amostra de medula óssea humana, as células T demonstraram uma redução no número de células em comparação com os monoblastos da mesma amostra. Outro benefício da citometria de massa é a capacidade de discriminar células em parada do ciclo celular ou que têm uma distribuição anormal do ciclo celular.
Uma grande vantagem desta técnica é que é facilmente compatível com outras medidas de citometria de massa, como fenotipagem de superfície, estrutura da cromatina, estimulado de citocinas intracelulares, que podem ser correlacionadas com o estado do ciclo celular. Usamos essa técnica para estudar a exaustão das células imunes, a senescência e mostrar que a resposta à quimioterapia em pacientes com leucemia aguda pode se correlacionar com as propriedades do ciclo celular das células leucêmicas.
