Протоколы ядра Hi-C позволяют исследовать хромосомное подтверждение с различным разрешением для характеристики хроматиновых петель, доменов и компартмента, организующих геном. Этот протокол обеспечивает профилирование геномных взаимодействий с высоким разрешением в различных масштабах, что дает более последовательный охват во всех диапазонах геномных расстояний и данных с меньшим техническим шумом. Сочетание этого протокола с генетическим редактированием является мощной стратегией тестирования структурной функции генетических элементов.
Он также может быть применен для характеристики структурных изменений, которые приводят к заболеванию. Протокол ядра Hi-C может быть применен для изучения организации генома любого эукариотического генома. Обработка SDS и Triton дезагрегирует любые ядерные сгустки путем пипетирования, поскольку агрегаты влияют на эффективность ферментативной реакции, и обязательно выполните соответствующие меры контроля качества перед секвенированием.
Начните с добавления формальдегида без метанола в один раз 10 к семи клеткам Schneider's Line 2 Plus Drosophila в 17,5 миллилитрах среды Schneider, дополненной 10% FBS до конечной концентрации 2%, инкубируют клетки в течение 10 минут при комнатной температуре с смешиванием каждые 60 секунд или на вращающемся колесе и добавляют глицин до конечной концентрации 0,125 моляра при смешивании. Через пять минут при комнатной температуре и 15 минут на льду соберите клетки путем центрифугирования и осторожно повторно суспендировать гранулу в 25 миллилитрах холодного PBS и собрать клетки с помощью другого центрифугирования. В конце центрифугирования повторно суспендируют клетки в одном миллилитрах буфера ледяного холодного лизиса для подсчета и отрегулируют ячейки до однократного 10-шести клеток на миллилитр концентрации.
Инкубировать клетки на льду в течение 30 минут, переворачивая трубку каждые две минуты, чтобы смешать и собрать клетки с помощью другого центрифугирования. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитрах буфера холодного лизиса свежего льда. После центрифугирования промыть лисат одним миллилитом 1,25-кратного буфера.
Центрифуга снова для сбора лисата. Повторно суспендировать гранулу в 360 микролитров свежего рестестрирующего буфера и 11 микролитрах 10% SDS с тщательным пипетированием и инкубировать в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия и от 7 до 950 оборотов в минуту со случайным пипетированием. В конце инкубации остановите пермеабилизацию 75 микролитрами неионного поверхностно-активного вещества и верните трубку в инкубатор еще на 45 минут с встряхиванием со скоростью 950 оборотов в минуту с периодическим пипеткой.
Для переваривания хроматина добавьте 200 единиц Mbo1 в трубку для четырех-16-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия с вращением. В конце инкубации инактивируют фермент 20-минутной инкубацией при 60 градусах Цельсия. Чтобы заполнить свесы рестренирующего фрагмента и обозначить концы ДНК биотином, добавляют по 1,5 микролитра на каждый из 10 миллимоляров dCTP, dGTP, dTTP, 20 микролитров 0,4 миллимолярного биотина dATP, 17,5 микролитра триса с низким буфером ЭДТА и 10 микролитров по пять единиц на микролитр ДНК-полимеразы на один большой фрагмент в трубку при тщательном перемешивание.
Инкубируют реакцию в течение 75 минут при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 700 оборотах в минуту каждые 10 секунд в течение 30 секунд. В конце инкубации добавьте к хроматину лигационную смесь и отрегулируйте ее до одного миллилитра конечного реакционного объема с тщательным мягким перемешиванием и инкубируйте в течение ночи при 16 градусах Цельсия. Чтобы разложить образец белков, добавьте в пробирку 50 микролитров по 10 миллиграмм на миллилитр протеиназы К для двухчасовой инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации увеличьте температуру до 65 градусов цельсия в течение ночи, чтобы обратить вспять сшивание образца. На следующее утро разложите РНК с 10 микролитрами по 10 миллиграмм на миллилитр РНК А. Через час при 37 градусах Цельсия добавьте в пробирку один объем фенолхлороформа и тщательно перемешайте путем инверсии для получения однородной белой фазы. После осаждения ДНК в соответствии со стандартными протоколами количественно оцените ДНК с помощью фторогенного красителя, который избирательно связывается с ДНК, и флуорометра в соответствии с инструкциями производителя.
Чтобы очистить ДНК от непереваренных и переваренных аликвот, загрузите 100 нанограммов непереваренных, переваренных и лигированных образцов на гель с 1,5% агарозой и найдите мазок, центрированный около 500 пар оснований в переваренный образец, по сравнению с высокомолекулярной полосой для лигированного образца. Чтобы проверить маркировку Hi-C и эффективность лигирования путем амплификации и переваривания известного взаимодействия, после ПЦР переварите продукты с Mbo1, Cla1 или обоими и запустите образцы на новом 1,5-2% геля, чтобы можно было оценить относительное число 3C и Hi-C лигационных переходов. После обжига образца ультразвуком для получения от 200 до 500 фрагментов ДНК пары оснований перенесите 130 микролитров с пятью микрограммами ДНК из каждого образца в новые микроцентрифужные пробирки, содержащие 16 микролитров 10X лигационного буфера, два микролитра 10 миллимоляров dATP, пять микролитров ДНК-полимеразы Т4 и семь микролитров двойной дистиллированной воды для 30-минутной инкубации при 20 градусах Цельсия.
В конце инкубации добавляют пять микролитров 10 миллимолярных дНТП, четыре микролитра 10-кратного лигационного буфера, пять микролитров полинуклеотидкиназы Т4, один микролитр ДНК-полимеразы, один большой фрагмент и 25 микролитров двойной дистиллированной воды в пробирки для второй 30-минутной инкубации при 20 градусах Цельсия. Чтобы выбрать фрагменты в основном в диапазоне размеров от 250 до 550 пар оснований, выполните последовательный выбор обратимой твердофазной и мобилизационной величины с 0,6X, затем 0,9X в соответствии с инструкциями производителя и элюируйте ДНК 100 микролитрами триса с низким ЭДТА. Для вытягивания биотина для каждой библиотеки дважды промывайте 150 микролитров магнитных шариков, связанных со Стрептавидином, 400 микролитрами буфера 1X Tween и вращайте образцы в течение трех минут на вращающемся колесе.
В конце инкубации повторно суспендировать бусины в 300 микролитрах буфера 2X no Tween и смешать с 300 микролитрами материала Hi-C для 30-минутного вращения на вращающемся колесе. В конце инкубации промыть бусины 400 микролитрами буфера 0,5X Tween для трехминутной инкубации при 55 градусах Цельсия и 750 оборотах в минуту, а затем две промывки в 200 микролитров 1X буфера ограничения на стирку. После второй промывки повторно суспендировать шарики в 100 микролитрах хвостовой смеси dATP для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации повторно суспендировать шарики в 50 микролитрах 1X лигационного буфера и перенести суспензию в новую трубку, содержащую четыре микролитра предварительно отожженных парных концевых адаптеров и два микролитра Т4-лигазы. Через два часа при комнатной температуре удалите супернатант и дважды вымойте бусины 400 микролитрами буфера Tween, затем вымойте бусины один раз с 200 микролитрами буфера без Tween и один раз со 100 микролитрами буфера ограничения, прежде чем повторно приостановить бусины в 40 микролитрах буфера ограничения 1X. Мазок от 200 до 1000 пар оснований наблюдается при успешном ограничении Mbo1.
Если лигирование успешное, в верхней части геля наблюдается высокомолекулярная полоса. Эффективность пищеварения также может быть подтверждена количественной ПЦР. Приемлемая эффективность пищеварения составляет 80% или выше.
Как показано на рисунке, амплификация известного взаимодействия среднего диапазона в продуктах лигирования Hi-C может быть оценена путем переваривания продукта ПЦР, восстановленного в амплификации. Эффективность переваривания более 70% рекомендуется, чтобы избежать большой доли бесполезных чтений для библиотек после секвенирования. Количество циклов ПЦР для окончательной амплификации должно быть на один цикл меньше, чем количество циклов, для которых виден мазок.
Уровень усвоения библиотеки указывает на обилие допустимых пар Hi-C и отражает долю полезных чтений, которые будут получены из библиотеки. Используя уникальные допустимые пары Hi-C, можно выполнить базовый анализ распределения пар. Как видно в этом репрезентативном примере, локус гена NOTCH можно увидеть вместе с архитектурными белками, доменами один и два и модификациями гистонов вдоль локуса.
При удалении области, содержащей как CTCF, так и M1BP сайты связывания ДНК, может наблюдаться резкое изменение контактов хроматина. После эксперимента Hi-C можно выполнить a для достижения определенного набора контактов, например, из регионов промоутера. Это особенно полезно при оценке больших геномов.
Как показано, сочетание протокола Hi-C с генетическим добавлением может быть использовано для оценки структурной и регуляторной функции геномных элементов.
