Эти чувствительные стратегии могут быть использованы для оценки эффективности ингибирования химических ингибиторов и в сочетании с удалением гена CRISPR-Cas9 для исследования целей препарата. Вместо того, чтобы использовать анализ конечных точек, рост паразитов можно контролировать с течением времени, чтобы позволить расчет паразита удвоение времени с помощью чувствительного белка репортера. Этот анализ потенциально может быть расширен в 384 или 1536 микропластиров для тестирования нескольких соединений или для скрининга библиотек в высокой пропускной способности.
Эта стратегия может быть изменена для количественной оценки роста других внутриклеточных микробных патогенов и их реакции на препарат, представляющий интерес. Для выполнения люциферазы основе Toxoplasma роста анализа, начните с тщательного аспирации среды из предварительно посеянных 96-хорошо микроплета культур человеческой цыпы фибробластов и привить 150 микролитров паразита B подвески в скважины в три колонки пять строки формате. После четырехчасовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры, тщательно аспирировать среды из каждого колодца, чтобы удалить не вторгшихся паразитов и заполнить колодцы в каждом, но первый ряд с комнатной температурой фенол красный свободной среде.
Затем добавьте 100 микролитров 12,5 микромолярной люциферазы субстрата раствора в PBS в каждый колодец верхнего ряда и инкубировать микроплатформы в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить полный лиз клеток. В конце инкубации измерьте активность люциферазы на считыватель микроплатформы. Каждое чтение представляет собой первоначальное число вторглись паразитов на четыре часа после заражения.
Повторите анализ каждые 24 часа в течение следующих четырех дней без изменения среды. Для расчета нормализованного складного изменения роста паразитов, каждое чтение может быть разделено на первоначальное чтение на четыре часа после инфекции. Бревно 2 нормализованного складного изменения роста паразитов может быть построено против каждой точки времени и подвергнуто линейной функции регрессии для получения склона, который представляет собой удвоение времени.
Чтобы оценить эффективность ингибирования соединения интереса на рост Токсоплазмы, культура человеческой крайней мяты фибробластов в 96-хорошо микропластов, по крайней мере семь дней, прежде чем инокулировать каждый колодец клеток с 150 микролитров паразитов, как попродемонстрировано в течение четырех часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Во время инкубации, подготовить соединение интереса в восьми различных концентрациях в 12-хорошо водохранилище путем последовательного разбавления. Разбавить соединения в 12-хорошо резервуар на один-три разбавления путем трубопроводов каждой смеси вверх и вниз несколько раз с одной миллилитровой пипетки.
На четыре часа после инфекции, заменить средний в каждом хорошо из столбцов два-девять с 150 микролитров среднего дополняется с каждым разбавления соединения, в результате чего первая колонка заполнена регулярной среде служить в качестве необработанные контроля. Затем верните клеточные культуры в инкубатор клеточной культуры в течение 96 часов и измерьте активность люциферазы для каждой хорошо, чтобы определить процент ингибирования роста в культурах при каждой концентрации соединения. Чтобы рассчитать нормализованную активность люциферазы в процентах, разделите среднюю активность люциферазы для каждой концентрации соединения на среднюю активность люциферазы, полученную от необработавных паразитов.
Затем используйте соответствующую программу графирования для построения нормализованной деятельности люциферазы против отдельного соединения и расчета половины максимальной ингибирующей концентрации для каждого соединения. Для создания плазмидной конструкции, выражаюной одногидную РНК и Cas9 для удаления гена, представляющих интерес, перейдите на страницу Toxoplasma Genomics Resource и получите всю последовательность кодирования генов, включая интроны и экзоны, а также 1,5-килограммовую пяти- и три основных непереведенных региона. Скопируйте полученную последовательность TgCPL в программное обеспечение для анализа последовательности и помечтируйте пять и три основных непереведенных региона.
На странице ресурсов геномики Toxoplasma нажмите Скачать, Файлы данных и Current_Release. В папке T.gondii GT1 выберите FASTA. Из папки данных загрузите файл последовательности генома Toxoplasma gondii GT1.
Затем создайте локализовую папку под названием Toxoplasma Genome в программном обеспечении анализа последовательности ДНК и импортируют файл последовательности генома Токсоплазмы в папку. Выберите инструменты, клонирование и найти CRISPR сайты и установить три премьер Cas9 премьер для расположения сайта PAM. Выберите одногидную РНК, которая демонстрирует высокий балл специфичности, как правило, больше, чем 98% и не имеет G после NGG.
Выбранная одногидная РНК обычно расположена на участках, близких к началу, и останавливает кодоны гена интереса. Затем используйте премикс ПЦР с настройками, указанными в таблице, для выполнения реакции ПЦР для изменения уже существующих плазмидных экспрессии одногидной РНК, которая нацелена на ген TgUPRT. Для трансфекции Токсоплазмы смешайте два микрограмма отремонтированной ДНК шаблона с 20 микрограммами одногидной плазмиды экспрессии РНК Cas9 и смешайте 400 микролитров паразита resuspension, ДНК и пять микролитров 200 миллимолярной АТФ 500 миллимолейра уменьшенного глутатиона в 1,5 миллилитровой центрифуге трубки.
Добавьте буфер cytomix, чтобы принести общий объем до 500 микролитров по мере необходимости и перенести смесь ДНК паразита в четырехмиллиметровый зазор с куветтом электропорации. Затем электропорат паразитов на два киловольта и 50 ом сопротивления. Чтобы клонировать нокаут паразитов, сначала выполнить двухшаговое разбавление паразитов для достижения 10 паразитов на миллилитр D10 среды дополняется соответствующей концентрации антибиотиков.
Затем перенесите 150 микролитров очищенных очищенных паразитов в каждую колодец микроплоцита 96-колодец, предварительно посеянного с фибробластами крайней цыпы, и инкубировать микропластит при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение семи дней. В конце инкубации определите скважины, содержащие один налет, и перенесите 75 микролитров резузпендной токсоплазмы, инфицированной человеческой макиной миомой, из каждой скважины 96-колодец микроплита культуры в отдельные 1,5 миллилитровые трубки. Соберите клетки путем центрифугации и повторно посовестите гранулы в 10,25 микролитров буфера лиза, содержащего буфер разбавления в добавке для высвобождения ДНК.
Затем инкубировать образцы в течение четырех минут при комнатной температуре и две минуты при температуре 98 градусов по Цельсию, прежде чем выполнять ПЦР для проверки на интеграцию лекарственной устойчивости кассеты и потери гена интереса. Эффективность ингибирования LHVS и дикого типа в дельта CPL штаммов может быть определена путем построения их люциферазы деятельности против различных концентраций ингибитора. После ПЦР мутировавшая плазмида линейно и загружается в гель 1%agarose для проверки успешного усиления.
После экстракции геля и преобразования E.coli, клоны, содержащие ожидаемые плазмиды, могут быть проверены путем ограничения пищеварения эндонуклеазы в секвенировании ДНК. После усиления шаблона ремонта электрофорез агарозного геля может быть использован для проверки правильного размера продукта ПЦР. Как правило, семь-восемь клонов отбираются для первоначального скрининга для проверки на удаление последовательности кодирования гена интереса, а затем обнаружение пяти и трех основных рук, чтобы помочь минимумизировать общее количество клонов, которые будут проверены.
Дальнейшая проверка может быть завершена путем иммуноблоттинга, если есть антитела, распознающие целевой белок. Перед получением измерений активности люциферазы, четкая микроплюль с макет инфекции должны быть проверены под микроскопом, чтобы убедиться, что паразиты не полностью лизировать клетки-хозяина.
