Поскольку в легких находится очень сложная и уникальная иммунная система, было разработано и сообщено о нескольких стратегиях определения иммунных клеток легких. Существование нескольких различных подходов затрудняет сравнение результатов, полученных различными лабораториями. Наша стратегия гейтинга обеспечивает комплексный и воспроизводимый способ идентификации до 12 различных легочных миелоидных и немиелоидных иммунных популяций с использованием девяти маркеров.
Настоящий протокол описывает характеристику и идентификацию иммунных популяций легких в стационарных условиях. Тем не менее, этот протокол может быть использован для выявления изменений этих клеточных популяций в различных моделях заболеваний, где он может помочь идентифицировать специфические для заболевания изменения иммунного ландшафта легких. Исследователи, которые выполняют эту технику впервые, должны обратить внимание на условия пищеварения и реагенты, так как они имеют большое значение в высвобождении иммунных клеток из легочной ткани.
Начните с подготовки усыпленного животного к операции. Стабилизируйте мышь дорсально, используя иглы или ленту на четырех конечностях, затем используйте 70% этанол для дезинфекции кожи вентральной области. Сделайте разрез от шеи до живота.
Удалите кожу с грудного отдела вместе с ребрами и грудиной. Промывайте легкие, вводя 10 миллилитров холодного PBS в правый желудочек с помощью иглы 18-21 калибра, пока они не станут полностью белыми. Затем удалите тимус и сердце, не касаясь легких.
Отделите легкие от окружающих тканей и перенесите их в трубку, содержащую холодный буфер BSA. Переложите легкое в чашку Петри, измельчите его с помощью двух тонких скальпелей, а затем поместите в 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте пять миллилитров буфера пищеварения, чтобы промыть пластину.
Закрепите крышку трубки и переваривайте легкое в течение 30 минут на орбитальном шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия. Остановите реакцию, добавив 10 миллилитров холодного буфера BSA. После пищеварения смешайте и растворите кусочки легких с помощью иглы 18-го калибра.
Поместите 70-микрометровый фильтрующий фильтр поверх новой 50-миллилитровой конической трубки и перенесите переваренную смесь легких в ситечко. Используйте резиновую сторону 10-миллилитрового плунжера шприца, чтобы разбить оставшиеся части легких на фильтре и промыть его буфером BSA. Центрифугировать одноэлементную суспензию при 350 Г в течение восьми минут при семи градусах Цельсия.
Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре буфера лизиса ACK. Смешайте суспензию с помощью одномиллилитровой пипетки и инкубируйте ее в течение 90 секунд при комнатной температуре. Добавьте 10 миллилитров холодного буфера BSA в реакционную смесь и центрифугируйте ее при 350 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия.
Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте гранулу в буфере окрашивания и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Повторное суспендирование клеток в концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр для окрашивания поверхности. Переместите 1 миллион ячеек по 200 микролитров на скважину в 96-луночную пластину и центрифугируйте пластину при 350 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия.
Готовят раствор блока проточной цитометрии путем разбавления антитела анти-1632 в буфере окрашивания. Повторное суспендирование клеток в 50 микролитрах раствора блока проточной цитометрии. Инкубировать суспензию в течение 15-20 минут при четырех градусах Цельсия или на льду.
Затем добавьте 150 микролитров окрашивающего буфера на пластину и центрифугируйте ее 350 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Готовят раствор поверхностных антител путем разбавления поверхностных антител в окрашивающем буфере. Повторно суспендируют клетки в 50 микролитрах поверхностного раствора антител и инкубируют пластину при четырех градусах Цельсия в темноте.
Затем дважды промыть клетки с помощью окрашивающего буфера. Подготовьте буфер фиксации и пермеабилизации, смешивая три части фиксирующего и пермеабилизирующего разбавителя и одну часть окрашивающего буфера. Повторно суспендируют клетки в 50 микролитрах предварительно подготовленного буфера на лунку 96-луночной пластины и инкубируют их в течение 20-25 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.
Разбавьте буфер пермеабилизации очищенной деионизированной водой, чтобы подготовить один раз буфер пермеабилизации, и используйте его для промывки клеток. Готовят внутриклеточный раствор антител путем разбавления одним миллилитром пермеабилизационного буфера. Повторно суспендируют клетки в 50 микролитрах разбавленного внутриклеточного раствора антител на лунку 96-луночной пластины и инкубируют в течение 40 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.
Промыть клетки буфером пермеабилизации, затем буфером окрашивания. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 200 микролитров окрашивающего буфера. Приобретите минимум 1,5 миллиона клеток на образец на проточном цитометре.
После успешной операции и соответствующей послеоперационной процедуры обломки и дублеты были исключены с помощью стратегии гатинга. Иммунные клетки были идентифицированы с использованием маркера CD45 + кроветворения с помощью проточной цитометрии. Клетки различались как живые или мертвые.
Иммунные клетки легких были разделены на три группы с использованием антител против GR-1 и против CD68. Нейтрофилы были идентифицированы и проверены с использованием Ly6G в качестве уникального маркера. Популяция CD45 + также содержит естественные клетки-киллеры, Т-клетки и В-клетки.
Эти клетки были окрашены и проверены естественными антителами-киллерами 1.1, CD3 и B220. Бронхоальвеолярный лаваж идентифицировал эозинофилы, которые были положительными для маркера CD11b, и альвеолярные макрофаги, которые не экспрессировали высокие уровни CD11b. CD45 + дендритные клетки были обнаружены и подтверждены экспрессией CD24.
Эти клетки показали либо положительный, либо отрицательный ответ на маркеры CD103 и CD11b. CD103 отрицательные клетки были классифицированы как обычные и моноцитарные дендритные клетки на основе экспрессии CD64. дендритные клетки, полученные из моноцитов, были низкоположительными для дендритного маркера CD24 и положительными для маркера пан-макрофагов CD64.
Различают интерстициальные макрофаги с классическими и неклассическими моноцитами на основе экспрессии CD64 и GR-1. Эти клетки показали положительную экспрессию для рецептора хемокина CX3C. Наиболее важными шагами в этой процедуре являются правильный сбор тканей, пищеварение и приготовление одноклеточной суспензии, а также захват живых клеток и синглетов.
В дополнение к характеристике иммунных клеток легких с помощью проточной цитометрии, клеточная культура и функциональные анализы могут быть выполнены в изолированных клеточных популяциях. Этот метод может проложить путь для исследователей для изучения новых вопросов в заболеваниях легких, таких как инфекции, аутоиммунные заболевания и рак.
