Это простой и эффективный метод изоляции и культивирования первичных перицитов мозга для изучения межклеточной сигнализации кальция. Полученная культура клеток является почти однородной популяцией перицитов, и ее просто загрузить перициты для визуализации кальция. Методы, описанные здесь, должны предоставить другим исследователям в этой области сильные инструменты для изучения перицитовой биологии и внутриклеточной сигнализации в перицитах in vitro.
Начните с оттаивания одного флакона капилляров в водяной бане 37 градусов по Цельсию. После того, как капилляры оттаяли, перенесите их в центрифугу трубку с 30 миллилитров DMEM comp, и центрифуга их в течение пяти минут при 500 раз G.Then, удалить среду из трубки, и повторно приостановить палитру в 10 миллилитров свежего DMEM комп. Перенесите подвеску в фляг с покрытием Т-75 и позвольте капиллярам прилипать к дну в течение четырех-шести часов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, снабженному 10%-ным углекислым газом.
После инкубации осмотрите колбу под световым микроскопом. Фракции капилляров теперь должны быть прикреплены к нижней части колбы. На четвертый день после посева капилляров, осмотрите их под микроскопом, чтобы убедиться, что они примерно от 60 до 70% стечения.
Аспирировать среды, и аккуратно мыть клетки с PBS. Добавьте два миллилитров разморожевания трипсина-ЭДТА и оставьте колбу в инкубаторе на одну-три минуты, часто вынося колбу и наблюдая за отслоением клеток с помощью микроскопа. Когда эндотелиальные клетки начинают округляться, осторожно коснитесь колбы, чтобы отсоединить их.
Когда клетки отсоединились, прекратите трипсинизацию, добавив в колбу 10 миллилитров комп DMEM. Промыть колбу несколько раз со средой, и аспирировать эндотелиальной клеточной подвески, которые теперь могут быть использованы для других целей. Добавьте 10 миллилитров DMEM comp в колбу и проверьте его под световым микроскопом, чтобы убедиться, что перициты все еще присутствуют и прикреплены к дну.
Затем поместите колбу обратно в инкубатор, чтобы перицит-обогащенной культуры расти. Чтобы семени перицитов в покрытие 96-хорошо пластин, отделить их, как описано в рукописи текста. Аспирировать среды, заботясь, чтобы не беспокоить гранулы клетки, и повторно приостановить гранулы в один миллилитр свежего DMEM комп.
Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры, а затем вычислите объем суспензии, который должен быть добавлен в каждую колодец, чтобы посеять 10 000 клеток на колодец. Добавить подвеску клетки, а затем добавить достаточно DMEM комп к клеткам для достижения общего объема 200 микролитров на колодец. Когда готовы загрузить перициты с Fura-2 AM кальций индикатор красителя, принять 96-хорошо пластины с клетками из инкубатора, и аспирировать среды из колодцев.
Вымойте клетки дважды с помощью буфера анализа и добавьте 100 микролитров погрузочного раствора в каждую колодец. Оберните пластину фольгой, чтобы избежать отбеливания фото, и инкубировать его в течение 45 минут с 30 об / мин встряхивания при комнатной температуре. После инкубации, аспирировать буфер загрузки, и мыть клетки с помощью буфера анализа в два раза.
Добавьте 100 микролитров свежего, чтобы проецировать буфер, и оставьте клетки инкубировать в течение 30 минут. После инкубации установите температуру считывателя пластины до 37 градусов по Цельсию и перенесите 96-хорошую пластину с клетками в положение образца пластины, затем поместите реагентную пластину с агонистом в положение реагентной пластины. Начните с измерения нагрузки клеток для обеспечения равной нагрузки Fura-2 AM во всех скважинах, затем выполните измерения с возбуждением флуоресценции длины волны на 340-380 нанометров, а длина волны выбросов на 510 нанометров.
Добавьте 50 микролитров агониста со скоростью 150 микролитров в секунду, от реагентной пластины до каждой хорошо с клетками. Накройте крышку скольжения в камеру клетки, и затянуть его, чтобы избежать утечек. Добавьте DMEM comp и рассчитанный объем подвески ячейки в каждую камеру, для конечного объема в 500 микролитров.
Инкубировать клеточные камеры при 37 градусах по Цельсию и 10%углекислого газа в течение шести дней, или до слияния. После того, как клетки стекут, возьмите камеры клеток из инкубатора, и аспирировать среды. Вымойте клетки дважды с помощью буфера анализа и добавьте 500 микролитров буфера загрузки в каждую камеру, затем инкубировать их при комнатной температуре в течение 45 минут.
После инкубации, аспирировать погрузочный буфер, и мыть клетки дважды с помощью буфера анализа, а затем добавить 500 микролитров свежего буфера анализа в каждой камере и инкубировать их еще 30 минут при комнатной температуре, чтобы расщепление АМ-эстер. Замените буфер 500 микролитров буфера свежего анализа и прополкайте живую визуализацию в конфокальцаторе. Намонтировать камеру клетки на стадии микроскопа как можно мягче, чтобы избежать нарушения клеток.
Установите длину волны возбуждения на 488 нанометров, выброс на 515 нанометров, двухминутное последовательное получение изображения с пятью секундными интервалами и размер изображения 512 на 512 пикселей. Добавьте 300 микролитров 100 миллимолярной АТФ в камеру клетки и инициируют получение изображения. Этот протокол был использован для очистки перицитов от капилляров мозга крупного рогатого скота.
Сотовый результат из семенных капилляров был изображен в течение девяти дней. Капилляры были полностью прикреплены к колбе в первый день, и на второй день, эндотелиальный прорастания было видно. Через четыре дня клеточный нарой был отличительным, и эндотелиальные клетки были удалены с помощью трипсинизации.
Остатки капилляров присутствовали после трипсинизации, но исчезли из колбы в последующие дни. После удаления эндотелиального слоя перицитам разрешалось расти до слияния. На девятый день перициты достигли примерно 80% слияния, и образовались острова.
Добавление АТФ в загруженные перициты Фура-2 привело к повышению уровня цитозоля кальция. Реакция произошла сразу же после добавления АТФ к перицитам и медленно снижалась в течение измеренного периода времени. Реакция кальция также измерялась с помощью конфокальных изображений в режиме реального времени.
Базовая флуоресценция была измерена, затем АТФ был добавлен на 64 секунд, и сильная внутриклеточная реакция кальция была очевидна. Вскоре после этого в клетках был виден цитозолированный кальций, и было видно уменьшение площади клеток. К 300 секундам площадь клетки сильно уменьшилась, а флуоресценция снизилась почти до базовых уровней.
Этот метод был использован для получения первых внутриклеточных измерений кальция из первичных перицитов мозга, демонстрируя, что перициты стимулируются через АТФ, и способны контракт в пробирке.
