Общая цель этой процедуры заключается в производстве и очистке яйцеклетки BDNF в оптимизированном протоколе, включающем трансфекцию клеток HEK293 и очистку в колонке хроматографии. Овидук BDNF затем моно-биотинилируется реакцией in vitro для задней маркировки и обнаружения с помощью микроскопии флуоресценции. Основным преимуществом этой процедуры является то, что она позволяет оптимизировать производство, очистку и монобротинилляцию БДНФ.
Параметры беременности были оптимизированы для максимального производства BDNF с использованием экономически эффективного трансфектационного реагента, а процесс очистки выполняется в хроматографической установке, которая облегчает манипуляции и позволяет обострить процедуру. Начните с разбавления 60 микрограммов полиэтиленимин в 500 микролитров неотгряплененных DMEM и 20 микрограммов овидук плазмид BDNF в 500 микролитров неотгряплюментированных DMEM на 15 сантиметров блюдо, чтобы быть трансфицированы. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем тщательно пипетки раствор ДНК в полиэтиленимин трубки, смешивая один раз вверх / вниз движения.
Инкубировать в течение 25 минут при комнатной температуре, а затем капать один миллилитр смеси PEI / ДНК в течение каждого 15 сантиметров блюдо. Инкубировать клетки смесью PEI/DNA в течение трех часов, а затем изменить средний буфер инкубации. Через 48 часов после трансфекции клеток, собирать носитель из всех блюд.
Затем добавьте средние компоненты BDNF к супернатанту HEK293, включая хлорид натрия, буферные компоненты фосфата, имидазол и ингибиторы протеазы. Инкубировать во льду в течение 15 минут. Затем aliquot среды в центрифуги труб.
Центрифуга в течение 45 минут при 10 000 г в четырехградусах золотой центрифуге По Цельсию. Этот шаг позволяет ликвидировать клеточный мусор и мертвые клетки, подвешенные в средствах массовой информации. Затем соберите супернатанты.
Добавить BSA при конечной концентрации 0,1% и хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию на срок до двух месяцев. Чтобы очистить BDNF, начните с оттаивания средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию терморегулируемой ванне. Затем aliquot средств массовой информации в центрифуги труб.
Центрифуга в течение одного часа при 3500 г в четырехградумной золотой центрифуге Цельсия. Этот шаг позволяет ликвидировать оставшийся мусор для обеспечения адекватного потока через колонку хроматографии. Затем используйте белковые концентраторы, чтобы уменьшить медиа от 500 миллилитров до 100 миллилитров.
Следуйте рекомендуемым производителем параметрам центрифугации для оптимальной концентрации. Затем добавьте 500 микролитров шариков никеля-НТА агарозы в концентрированные средства массовой информации и инкубировать на ночь в рокере при четырех градусах цельсия. На следующий день соберите хроматографический аппарат и вылейте в него средства массовой информации.
Пусть он отдыхает в течение пяти минут, а затем открыть двухкую сторону остановить петух, чтобы средний поток до конца. Вымойте с пятью миллилитров мыть буфера в течение пяти минут убедившись, что повторно использовать бисер в колонке. Повторите три раза.
Наконец, добавьте один миллилитр буфера elution в столбец, убедившись, что повторное помещение бусин. Инкубировать в течение 15 минут, а затем собрать элюент в трубке микроцентрифуг. Повторите этот шаг три раза для полного элауляции BDNF.
Для биотинилата BDNF возьмите алицит, содержащий 800 нанограммов белка, и добавьте биотиниляционный буферный реагент, а затем некоторые BirA-GST в один-к-одному молярное отношение к BDNF. Инкубировать в духовке гибридизации при температуре 30 градусов по Цельсию в течение 60 минут, смешивая содержимое трубки каждые 15 минут инверсией. Затем добавьте тот же объем АТФ и BirA-GST, что и на первом этапе, и инкубировать в течение 60 минут, смешивая содержимое трубки каждые 15 минут.
Биотинилированный BDNF может быть оставлен во льду для немедленной проверки биотинилирования или храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию для заднего анализа. Чтобы проверить биотинилирование яйцеклетки BDNF, начните с блокирования 30 микролитров стрептавидина магнитных бусин на образец BDNF в блокирующего буфера. Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа, а затем осадок магнитных бусин в магнитной стойке сепаратора, а затем отказаться от блокирующего буфера.
Добавьте 50 микролитров свежего блокирующего буфера и образец BDNF к бисеру, убедившись, что повторно их полностью. Гомогенизировать содержимое трубки и инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа в микроцентрифуге трубки ротатора. Подготовь образец для западного blotting как описано в тексте для того чтобы оценить эффективность реакции биотинилирования.
Чтобы спрягать овидук BDNF к квантовым точкам, начните с добавления необходимого объема квантовых точек для достижения один к одному молярного отношения к BDNF, а затем разбавить до конечного объема 20 микролитров. Гомогенизировать содержимое трубки, а затем завернуть его в алюминиевую фольгу, чтобы защитить его от света. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в рокер.
Затем разбавить овидук BDNF до нужной конечной концентрации и добавить его в аксональный отсек микрофлюидной камеры, инкубации в течение 210 минут для задней живой или фиксированной визуализации клеток. Использование протокола на основе хроматографической колонки позволяет обрабатывать значительные объемы кондиционированных средств массовой информации HEK293. В этом эксперименте, 500 миллилитров условных средств массовой информации были обработаны для очистки овидука BDNF.
Четыре последовательных элюция продолжительностью 15 минут каждый дали снижение концентрации овидука BDNF в диапазоне от шести до 28 нанограмм на микролитер. Общий урожай составил около 60 микрограммов яйцеклетки BDNF. Этот очищенный BDNF был затем биотинилирован реакцией in vitro при посредничестве BirA-GST.
Образец был однородно биотинилирован, о чем свидетельствует отсутствие не биотинилированного яйцеклетки BDNF в сверхнатанте магнитного буфера с шариком. Эти результаты показывают, что предлагаемый протокол позволяет очищать значительное количество яйцеклетки BDNF и однородной моно-биотинилирования in vitro. Затем с помощью двух различных экспериментальных подходов оценивалась биологическая активность моно-биотинилированного БДНФ.
Сначала корковые нейроны, посеянные в 60-миллиметровых пластинах, стимулировались 50 нанограммами на миллилитр моно-биотинилированного BDNF в течение 30 минут, а затем белки были подготовлены для анализа западных помарк. Биологическая активность монобиотинилированного БДНФ была количественно оценена путем обнаружения фосфо-тркБ и фосфо-ЭРК. Связывание BDNF с TrkB вызывает авто-фосфорилирование рецептора и активацию нескольких нисходящих киназ, включая ERK.
Негативное состояние контроля, которое не стимулировалось BDNF и положительное состояние контроля, которое стимулировалось с коммерчески доступным BDNF были включены для анализа биологической активности oviduct BDNF. Полосы были как фосфорилированные белки, имели аналогичную интенсивность в нейронах, обработанных коммерческим BDNF и моно-биотинилированных BDNF, и оба показали более сильный сигнал, чем отрицательное состояние контроля. Затем была оценена биологическая активность моно-биотинилированных BDNF в сочетании со стрептавидидиными квантовыми точками, чтобы продемонстрировать, что они могут быть использованы в живых экспериментах по визуализации.
Кортикальные нейроны были посеяны в 10 миллиметровых чехлов и обработаны с окончательной концентрацией 200 пикомолярных или двух наномолярных BDNF квантовых точек в течение 30 минут до фиксации и окрашивания для фосфо-CREB. CREB является транскрипционным фактором, который является мишенью активированного ERK12 в корковых нейронах. Стимулирование нейронов с увеличением концентрации квантовых точек BDNF привело к дозозависимым увеличению фосфорилирования CREB и наличию частиц квантовой точки, окружающих ядро, что указывает на то, что частицы квантовой точки BDNF были эндоцитозными и вызвали активацию сигнальных путей, связанных с активацией TrkB при посредничестве BDNF.
Двухкратное увеличение сигнала фосфо-CREB было обнаружено при стимулировании нейронов с 200 пикомолярными квантовыми точками BDNF, в то время как стимулирование двумя наномолярными квантовыми точками BDNF привело к 3,5-кратному увеличению сигнала фосфо-CREB. Таким образом, биотинилированный овидук BDNF биологически активен и не теряет активности в сочетании со стрептавидидиными квантовыми точками, что делает его пригодным для иммунофторесценции и визуализации живых клеток. Наконец, потенциал изображения квантовых точек BDNF оценивался в разрозненных культурах с использованием микрофлюидных камер.
Кортикальные нейроны были посеяны в микрофлюидных камерах, чтобы отделить аксональные и соматодендритные отсеки и стимулировались двумя наномолярными квантовыми точками BDNF в течение 3,5 часов. Была проведена микроскопия живых клеток, и полученные кимографы были использованы для количественной оценки скорости квантовой точки BDNF, содержащей органеллы. Обнаружена средняя скорость движения 0,91 микрометра в секунду, что соответствует предыдущему анализу цитоплазмического тимин-опосредованного транспорта.
Микрофлюидные камеры, обработанные двумя наномолярными квантовыми точками стрептавидина, не показали движущихся квантовых точек в микро-группах, как показано на кимографе. Клетки, выращенные в тех же условиях, стимулировались 500 пикомолярными или двумя наномолярными квантовыми точками BDNF в течение 210 минут, а затем чиниться и маркироваться ядерным пятном. Нейроны, обработанные квантовыми точками BDNF, показывают доза-зависимое накопление помеченного белка во всех проанализированных подкомпартиях, включая проксимальные и дистальные части микрогруппы и соматодендритного отсека.
В отличие от этого, контрольные нейроны показали почти нет квантовой точки сигнала по всей камере. Таким образом, квантовая точка BDNF может быть обнаружена в живых и фиксированных клетках в микрофлюидных камерах. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как производить моно-биотинилированный овидук BDNF в хроматографии колонки на основе экономически эффективной процедуры.
