L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre e purificare l'ovidotto BDNF in un protocollo ottimizzato che prevede la trasfezione delle cellule HEK293 e la purificazione in una colonna cromatografica. L'ovidotto BDNF viene quindi mono-biotinilato da una reazione in vitro per l'etichettatura posteriore e il rilevamento mediante microscopia a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa procedura è che consente la produzione, la purificazione e la mono-biotinylazione del BDNF in modo ottimizzato.
I parametri di gestazione sono stati ottimizzati per la massima produzione di BDNF utilizzando un reagente di trasfezione economico e il processo di purificazione viene eseguito in una configurazione cromatografica che facilita la manipolazione e consente di aumentare la procedura. Inizia diluire 60 microgrammi di polietilenimina in 500 microlitri di DMEM non soppiantato e 20 microgrammi di plasmide di ovidotto BDNF in 500 microlitri di DMEM non soppiantato per piatto di 15 centimetri da trasfetto. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente e quindi pipettare con cura la soluzione di DNA in un tubo di polietilenimina, mescolando una volta per movimento su / giù.
Incubare per 25 minuti a temperatura ambiente e quindi gocciolare un millilitro della miscela PEI / DNA in ogni piatto di 15 centimetri. Incubare le cellule con la miscela PEI/DNA per tre ore e quindi cambiare il mezzo in tampone di incubazione. 48 ore dopo la trasfezione delle cellule, raccogliere il mezzo da tutti i piatti.
Quindi aggiungere i componenti medi BDNF al supernatante HEK293 tra cui cloruro di sodio, componenti tamponati da fosfato, imidazolo e inibitori della proteasi. Incubare nel ghiaccio per 15 minuti. Quindi aliquotare il mezzo in tubi di centrifuga.
Centrifuga per 45 minuti a 10.000 g in una centrifuga d'oro Celsius di quattro gradi. Questo passaggio consente l'eliminazione dei detriti cellulari e delle cellule morte sospese nei media. Quindi raccogli i supernatanti.
Aggiungere BSA a una concentrazione finale dello 0,1% e conservare a meno 20 gradi Celsius per un massimo di due mesi. Per purificare il BDNF, iniziare scongelando il supporto in un bagno termoregolato Celsius di 37 gradi Celsius. Quindi aliquotare il supporto in tubi di centrifuga.
Centrifuga per un'ora a 3.500 g in una centrifuga d'oro di quattro gradi Celsius. Questo passaggio consente l'eliminazione dei detriti rimanenti per garantire un flusso adeguato attraverso la colonna cromatografica. Quindi utilizzare i concentratori proteici per ridurre il supporto da 500 millilitri a 100 millilitri.
Seguire i parametri di centrifugazione consigliati dal produttore per una concentrazione ottimale. Quindi aggiungere 500 microlitri di perline di nichel-NTA agarosio al supporto concentrato e incubare durante la notte in un rocker a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, assemblare l'apparato cromatografico e versare il supporto in esso.
Lasciare riposare per cinque minuti e quindi aprire il cazzo di arresto a due per far scorrere il mezzo. Lavare con cinque millilitri di tampone di lavaggio per cinque minuti assicurandosi di rimorsi le perline nella colonna. Ripeti tre volte.
Infine, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione alla colonna assicurandosi di rimodere le perline. Incubare per 15 minuti e quindi raccogliere l'eluente in un tubo di microcentrifugo. Ripetere questo passaggio tre volte per l'eluizione completa del BDNF.
Per biotinilato il BDNF, prendere un'aliquota contenente 800 nanogrammi della proteina e aggiungere il reagente tampone di biotinilazione e quindi un po 'di BirA-GST in una relazione molare uno-a-uno con BDNF. Incubare in un forno di ibridazione a 30 gradi Celsius per 60 minuti, mescolando il contenuto del tubo ogni 15 minuti per inversione. Quindi aggiungere lo stesso volume di ATP e BirA-GST del primo passaggio e incubare per 60 minuti, mescolando il contenuto del tubo ogni 15 minuti.
Il BDNF biotinilato può quindi essere lasciato nel ghiaccio per una verifica immediata della biotinilazione o conservato a meno 80 gradi Celsius per l'analisi posteriore. Per verificare la biotinylazione dell'ovidotto BDNF, iniziare bloccando 30 microlitri di perline magnetiche streptavidin per campione di BDNF in un buffer di blocco. Incubare a temperatura ambiente per un'ora e quindi far precipitare le perline magnetiche in un separatore magnetico del rack e quindi scartare il tampone di blocco.
Aggiungere 50 microlitri di tampone di blocco fresco e il campione BDNF alle perline, assicurandosi di riprerne completamente. Omogeneizzare il contenuto del tubo e incubare a quattro gradi Celsius per un'ora in un rotatore del tubo a microcentrifugo. Preparare il campione per l'assorbimento occidentale come descritto nel testo per valutare l'efficienza della reazione di biotinylation.
Per coniugare l'ovidotto BDNF ai punti quantici, iniziare aggiungendo il volume necessario di punti quantici per ottenere una relazione molare uno-a-uno con BDNF e quindi diluire ad un volume finale di 20 microlitri. Omogeneizzare il contenuto del tubo e quindi avvolgerlo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti in un rocker.
Quindi diluire l'ovidotto BDNF alla concentrazione finale desiderata e aggiungerlo al compartimento assionale di una camera microfluidica, incubando per 210 minuti per l'imaging a celle posteriori vive o fisse. L'uso di un protocollo basato su colonne cromatografiche consente l'elaborazione di volumi significativi di supporti condizionati HEK293. In questo esperimento, 500 millilitri di mezzi condizionati sono stati elaborati per purificare l'ovidotto BDNF.
Quattro eluizioni consecutive della durata di 15 minuti ciascuna hanno prodotto concentrazioni decrescenti di ovidotto BDNF che vanno da sei a 28 nanogrammi per microlitro. La resa totale ammontava a circa 60 microgrammi di ovidotto BDNF. Questo BDNF purificato è stato poi biotinilato da una reazione in vitro mediata da BirA-GST.
Il campione è stato biotinilato in modo omogeneo, come dimostrato dalla mancanza di ovidotto BDNF non biotinilato nel supernatante del tampone cancellato perline magnetiche. Questi risultati mostrano che il protocollo proposto consente la purificazione di quantità significative di ovidotto BDNF e mono-biotinylazione omogenea in vitro. Quindi l'attività biologica del BDNF mono-biotinilato è stata valutata utilizzando due diversi approcci sperimentali.
In primo luogo, i neuroni corticali seminati in piastre da 60 millimetri sono stati stimolati con 50 nanogrammi per millilitro di BDNF mono-biotinilato per 30 minuti e quindi le proteine sono state preparate per l'analisi western delle macchie. L'attività biologica del BDNF mono-biotinilato è stata quantificata rilevando fosfo-TrkB e fosfo-ERK. Il legame del BDNF con il TrkB innesca l'auto-fosforilazione del recettore e l'attivazione di diverse chinasi a valle tra cui l'ERK.
Una condizione di controllo negativa che non è stata stimolata con BDNF e una condizione di controllo positiva che è stata stimolata con BDNF disponibile in commercio sono stati inclusi per l'analisi dell'attività biologica dell'ovidotto BDNF. Le bande erano entrambe proteine fosforilate, avevano un'intensità simile nei neuroni trattati con BDNF commerciale e BDNF mono-biotinilato, ed entrambe mostravano un segnale più forte della condizione di controllo negativo. Quindi è stata valutata l'attività biologica del BDNF mono-biotinilato accoppiato ai punti quantici di streptavidina per dimostrare che possono essere utilizzati in esperimenti di imaging dal vivo.
I neuroni corticali sono stati seminati in coperture da 10 millimetri e trattati con una concentrazione finale di 200 picomolari o due punti quantici BDNF nanomolari per 30 minuti prima del fissaggio e della colorazione per il fosfo-CREB. Creb è un fattore di trascrizione che è preso di mira da ERK12 attivato nei neuroni corticali. Stimolare i neuroni con concentrazioni crescenti di punti quantici BDNF ha comportato un aumento dose-dipendente della fosforilazione del CREB e la presenza di particelle di punti quantici che circondano il nucleo indicando che le particelle di punti quantici BDNF sono state endocitosate e hanno innescato l'attivazione di percorsi di segnalazione associati all'attivazione TrkB mediata da BDNF.
Un aumento di due volte del segnale fosfo-CREB è stato rilevato quando si stimolano i neuroni con 200 punti quantici BDNF picomolari, mentre stimolare con due punti quantici BDNF nanomolari ha portato a un aumento di 3,5 volte del segnale fosfo-CREB. Pertanto, l'ovidotto BDNF biotinilato è biologicamente attivo e non perde la sua attività se accoppiato a punti quantici di streptavidina che lo rende adatto per l'immunofluorescenza e l'imaging di cellule vive. Infine, il potenziale di imaging dei punti quantici BDNF è stato valutato in colture compartimentate usando camere microfluidiche.
I neuroni corticali sono stati seminati in camere microfluidiche per separare i compartimenti assonale e somatodendritico e sono stati stimolati con due punti quantici BDNF nanomolari per 3,5 ore. Fu eseguita la microscopia a cellule vive e i cimografi risultanti furono usati per quantificare la velocità del punto quantico BDNF contenente organelli. È stata rilevata una velocità media mobile di 0,91 micrometri al secondo, in linea con le precedenti analisi del trasporto citoplasmatico mediato dalla timina.
Le camere microfluidiche trattate con due punti quantici di streptavidina nanomolare non mostravano punti quantici in movimento nei micro gruppi come mostrato dal kymograph. Le cellule coltivate nelle stesse condizioni sono state stimolate con 500 picomolari o due punti quantici BDNF nanomolari per 210 minuti e quindi fissate ed etichettate con una macchia nucleare. I neuroni trattati con punti quantici BDNF mostrano un accumulo dose-dipendente della proteina etichettata in tutti i sottocompartmenti analizzati, comprese le porzioni prossimali e distali del microgruppo e del compartimento somatodendritico.
Al contrario, i neuroni di controllo non mostravano quasi nessun segnale di punto quantico in tutta la camera. Pertanto, il punto quantico BDNF può essere rilevato in cellule vive e fisse in camere microfluidiche. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre ovideduto BDNF mono-biotinilato in una procedura economica basata sulla cromatografia.
