Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung und Reinigung von BDNF-Oviduktion in einem optimierten Protokoll mit Transfektion von HEK293-Zellen und Reinigung in einer Chromatographie-Säule. Das BDNF-Oviduktionwird wird dann durch eine In-vitro-Reaktion zur hinteren Etikettierung und Detektion durch Fluoreszenzmikroskopie monobiotinyliert. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es die Produktion, Reinigung und Monobiotinylierung von BDNF in optimierter Weise ermöglicht.
Die Trächtigkeitsparameter wurden für die maximale BDNF-Produktion mit einem kostengünstigen Transfektionsreagenz optimiert und der Reinigungsprozess wird in einem Chromatographie-Setup durchgeführt, das die Manipulation erleichtert und eine Eskalation des Verfahrens ermöglicht. Beginnen Sie mit der Verdünnung von 60 Mikrogramm Polyethylenimin in 500 Mikroliter n.V. DMEM und 20 Mikrogramm BDNF-Oviktuktionsplasmid in 500 Mikroliter n.V. DMEM pro 15 Zentimeter Schale, die transfiziert werden soll. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann die DNA-Lösung vorsichtig in ein Polyethylenimin-Rohr zerlegen, einmal durch Auf-/Abwärtsbewegung mischen.
25 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann einen Milliliter der PEI/DNA-Mischung durch jede 15-Zentimeter-Schale tropfen. Inkubieren Sie die Zellen mit der PEI/DNA-Mischung für drei Stunden und ändern Sie dann das Medium in inkubationspuffer. 48 Stunden nach der Transfektion der Zellen, sammeln Sie das Medium aus allen Gerichten.
Fügen Sie dann die BDNF-Medium-Komponenten zum HEK293-Überstand hinzu, einschließlich Natriumchlorid, Phosphatgepufferte Komponenten, Imidazol und Proteasehemmer. 15 Minuten im Eis bebrüten. Dann aliquot das Medium in Zentrifugenrohre.
Zentrifuge für 45 Minuten bei 10.000 g in einer vier Grad Celsius Goldzentrifuge. Dieser Schritt ermöglicht die Beseitigung von Zellablagerungen und abgestorbenen Zellen, die in den Medien ausgesetzt sind. Dann sammeln Sie die Überstand.
Fügen Sie BSA bei einer Endkonzentration von 0,1% hinzu und lagern Sie bis zu zwei Monate bei minus 20 Grad Celsius. Um den BDNF zu reinigen, beginnen Sie mit dem Auftauen der Medien in einem 37 Grad Celsius thermoregulierten Bad. Dann aliquot die Medien in Zentrifugenröhren.
Zentrifuge für eine Stunde bei 3, 500 g in einer Vier-Grad-Celsius-Goldzentrifuge. Dieser Schritt ermöglicht die Beseitigung der verbleibenden Trümmer, um einen ausreichenden Durchfluss durch die Chromatographiesäule zu gewährleisten. Verwenden Sie dann die Proteinkonzentratoren, um die Medien von 500 Milliliter auf 100 Milliliter zu reduzieren.
Befolgen Sie die vom Hersteller empfohlenen Zentrifugationsparameter für eine optimale Konzentration. Dann 500 Mikroliter Nickel-NTA-Agarose-Perlen in die konzentrierten Medien geben und über Nacht in einer Wippe bei vier Grad Celsius brüten. Am nächsten Tag montieren Sie das Chromatographiegerät und gießen Sie die Medien hinein.
Lassen Sie es für fünf Minuten ruhen und öffnen Sie dann den Zwei-Wege-Stop-Hahn, um das Medium durchfließen zu lassen. Waschen Sie mit fünf Milliliter Waschpuffer für fünf Minuten, um sicherzustellen, dass die Perlen in der Säule wieder ausgesetzt. Wiederholen Sie dies dreimal.
Fügen Sie schließlich einen Milliliter Elutionspuffer zur Spalte hinzu, um sicherzustellen, dass die Perlen wieder angehalten werden. 15 Minuten inkubieren und dann das Eluent in einem Mikrozentrifugenrohr sammeln. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um BDNF vollständig zu elutionieren.
Um das BDNF zu biotinylatieren, nehmen Sie ein Aliquot, das 800 Nanogramm des Proteins enthält, und fügen Sie das Biotinylierungspufferreagenz und dann einige BirA-GST in einer 1:1-Molarenbeziehung zu BDNF hinzu. In einem Hybridisierungsofen bei 30 Grad Celsius für 60 Minuten inkubieren, den Inhalt des Rohres alle 15 Minuten durch Inversion mischen. Dann fügen Sie das gleiche Volumen von ATP und BirA-GST wie im ersten Schritt und inkubieren für 60 Minuten, mischen Sie den Inhalt der Röhre alle 15 Minuten.
Der biotinylierte BDNF kann dann zur sofortigen Biotinylierungsprüfung im Eis gelassen oder bei minus 80 Grad Celsius zur nachträden Analyse gelagert werden. Um die Biotinylierung des BDNF-Ovidukts zu überprüfen, beginnen Sie mit der Blockierung von 30 Mikrolitern Streptavidin-Magnetperlen pro BDNF-Probe in einem Sperrpuffer. Bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubieren und dann die Magnetperlen in einem magnetischen Rack-Separator ausfällen und dann den Sperrpuffer entsorgen.
Fügen Sie 50 Mikroliter frischen Sperrpuffer und die BDNF-Probe zu den Perlen hinzu, um sie vollständig wieder auszusetzen. Homogenisieren Sie den Inhalt des Rohres und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für eine Stunde in einem Mikrozentrifugenrohrrotator. Bereiten Sie die Probe für die westliche Blotting, wie im Text beschrieben, um die Effizienz der Biotinylierungsreaktion zu bewerten.
Um das BDNF-Oviddukt zu den Quantenpunkten zu konjugieren, beginnen Sie mit dem Hinzufügen des notwendigen Volumens von Quantenpunkten, um eine eins-zu-eins-Molar-Beziehung zu BDNF zu erreichen, und verdünnen Sie dann auf ein endgültiges Volumen von 20 Mikrolitern. Homogenisieren Sie den Inhalt des Rohres und wickeln Sie es dann in Aluminiumfolie, um es vor dem Licht zu schützen. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten in einer Wippe.
Verdünnen Sie dann das BDNF-Oviktiv auf die gewünschte Endkonzentration und fügen Sie es in das axonale Fach einer mikrofluidischen Kammer ein, die für 210 Minuten für die nachträge Live- oder Fixed-Zell-Bildgebung inkubiert wird. Die Verwendung eines säulenbasierten Chromatographieprotokolls ermöglicht die Verarbeitung signifikanter Volumina von HEK293 konditionierten Medien. In diesem Experiment wurden 500 Milliliter konditionierte Medien verarbeitet, um BDNF-Oviduct zu reinigen.
Vier aufeinander folgende Elutionen mit einer Dauer von jeweils 15 Minuten ergaben abnehmende Konzentrationen von BDNF-Oviduct im Bereich von sechs bis 28 Nanogramm pro Mikroliter. Die Gesamtausbeute betrug ca. 60 Mikrogramm BDNF-Oviduct. Dieser gereinigte BDNF wurde dann durch eine von BirA-GST vermittelte In-vitro-Reaktion biotinyliert.
Die Probe wurde homogen biotinyliert, wie das Fehlen von nicht-biotinylierten BDNF-Ovidukten im Überstand des magnetischen, strahlfreien Puffers zeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das vorgeschlagene Protokoll die Reinigung erheblicher Mengen an BDNF-Oviduct und homogener In-vitro-Monobiotinylierung ermöglicht. Anschließend wurde die biologische Aktivität des monobiotinylierten BDNF anhand zweier unterschiedlicher experimenteller Ansätze bewertet.
Zuerst wurden kortikale Neuronen, die in 60-Millimeter-Platten gesät waren, mit 50 Nanogramm pro Milliliter monobiotinyliertem BDNF für 30 Minuten stimuliert und dann Proteine für die Western-Blot-Analyse vorbereitet. Die biologische Aktivität des monobioylierten BDNF wurde durch den Nachweis von Phospho-TrkB und Phospho-ERK quantifiziert. Die Bindung von BDNF an TrkB löst die Automatische-Phosphorylierung des Rezeptors und die Aktivierung mehrerer nachgeschalteter Kiinasen einschließlich ERK aus.
Für die Analyse der biologischen BDNF-Oviktuktion wurden ein Negativkontrollzustand, der nicht mit BDNF stimuliert wurde, und eine positive Kontrollbedingung, die mit kommerziell erhältlichem BDNF stimuliert wurde, aufgenommen. Die Bänder waren beide phosphorylierte Proteine, hatten eine ähnliche Intensität in Neuronen, die mit kommerziellem BDNF und mono-biotinyliertem BDNF behandelt wurden, und beide zeigten ein stärkeres Signal als der negative Kontrollzustand. Dann wurde die biologische Aktivität von monobiotinyliertem BDNF gekoppelt mit Streptavidin-Quantenpunkten ausgewertet, um zu zeigen, dass sie in Live-Bildgebungsexperimenten verwendet werden können.
Kortikale Neuronen wurden in 10-Millimeter-Abdeckungen gesät und mit einer Endkonzentration von 200 Picomolar oder zwei nanomolaren BDNF-Quantenpunkten für 30 Minuten behandelt, bevor sie Phospho-CREB fixierten und färbten. CREB ist ein Transkriptionsfaktor, der von aktivierten ERK12 in kortikalen Neuronen gezielt wird. Die Stimulierung von Neuronen mit zunehmenden Konzentrationen von BDNF-Quantenpunkten führte zu einer dosisabhängigen Erhöhung der Phosphorylierung von CREB und der Anwesenheit von Quantenpunktteilchen, die den Kern umgeben, was darauf hindeutet, dass die BDNF-Quantenpunktteilchen endozytosiert wurden und die Aktivierung von Signalwegen im Zusammenhang mit der BDNF-vermittelten TrkB-Aktivierung auslöste.
Bei der Stimulierung von Neuronen mit 200 picomolaren BDNF-Quantenpunkten wurde eine zweifache Erhöhung des Phospho-CREB-Signals festgestellt, während die Stimulierung mit zwei nanomolaren BDNF-Quantenpunkten zu einer 3,5-fachen Erhöhung des Phospho-CREB-Signals führte. Daher ist das biotinylierte BDNF-Oviktiv biologisch aktiv und verliert seine Aktivität nicht, wenn es an Streptavidin-Quantenpunkte gekoppelt wird, was es für Immunfluoreszenz und Live-Zell-Bildgebung geeignet macht. Schließlich wurde das bildgebende Potenzial von BDNF-Quantenpunkten in kompartalisierten Kulturen mit hilfe mikrofluidischer Kammern ausgewertet.
Kortikale Neuronen wurden in mikrofluidischen Kammern gesät, um die axonalen und somatodendritischen Fächer zu trennen und wurden mit zwei nanomolaren BDNF-Quantenpunkten für 3,5 Stunden stimuliert. Die Live-Zellmikroskopie wurde durchgeführt und die resultierenden Kymographen wurden verwendet, um die Geschwindigkeit des BDNF-Quantenpunktes zu quantifizieren, der Organellen enthält. Es wurde eine durchschnittliche Gleitende Geschwindigkeit von 0,91 Mikrometern pro Sekunde nachgewiesen, die im Einklang mit der vorherigen Analyse des zytoplasmatischen Thymin-vermittelten Transports steht.
Mikrofluidische Kammern, die mit zwei nanomolaren Streptavidin-Quantenpunkten behandelt wurden, zeigten keine sich bewegenden Quantenpunkte in den Mikrogruppen, wie der Kymograph zeigt. Zellen, die unter den gleichen Bedingungen angebaut wurden, wurden 210 Minuten lang mit 500 Picomolar oder zwei nanomolaren BDNF-Quantenpunkten stimuliert und dann fixiert und mit einem nuklearen Fleck beschriftet. Neuronen, die mit BDNF-Quantenpunkten behandelt werden, zeigen eine dosisabhängige Akkumulation des markierten Proteins in allen analysierten Teilabteilungen, einschließlich der proximalen und distalen Teile der Mikrogruppe und des somatodendritischen Fachs.
Im Gegensatz dazu zeigten Kontrollneuronen fast kein Quantenpunktsignal in der gesamten Kammer. Daher kann der BDNF-Quantenpunkt in lebenden und festen Zellen in mikrofluidischen Kammern nachgewiesen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Mono-biotinyliertes BDNF-Oviduct in einem chromatographie-spaltenbasierten kostengünstigen Verfahren hergestellt werden kann.
