O objetivo geral deste procedimento é produzir e purificar oviduct BDNF em um protocolo otimizado envolvendo transfecção de células HEK293 e purificação em uma coluna de cromatografia. O oviduto BDNF é então mono-biotiningado por uma reação in vitro para rotulagem e detecção posterior por microscopia de fluorescência. A principal vantagem deste procedimento é que ele permite a produção, purificação e mono-biotiningação de BDNF de forma otimizada.
Os parâmetros de gestação foram otimizados para a produção máxima de BDNF usando um reagente de transfecção econômico e o processo de purificação é realizado em uma configuração cromatografia que facilita a manipulação e permite intensificar o procedimento. Comece diluindo 60 microgramas de polietilenimina em 500 microliters de DMEM nãoplementado e 20 microgramas de BDNF oviduct plasmid em 500 microliters de DMEM nãoplementado por prato de 15 centímetros a ser transfecido. Incubar por cinco minutos à temperatura ambiente e, em seguida, cuidadosamente pipeta a solução de DNA em um tubo de polietilenimina, misturando uma vez por movimento para cima/para baixo.
Incubar por 25 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, gotejar um mililitro da mistura PEI/DNA ao longo de cada prato de 15 centímetros. Incubar as células com a mistura PEI/DNA por três horas e, em seguida, alterar o tampão médio para incubação. 48 horas após a transfecção das células, recolhe o meio de todos os pratos.
Em seguida, adicione os componentes médios BDNF ao supernatante HEK293, incluindo cloreto de sódio, componentes tamponados de fosfato, imidazol e inibidores de protease. Incubar no gelo por 15 minutos. Em seguida, aliquotar o meio em tubos de centrífuga.
Centrífuga por 45 minutos a 10.000 g em uma centrífuga de ouro de quatro graus Celsius. Esta etapa permite a eliminação de detritos celulares e células mortas suspensas na mídia. Então recolha os supernantes.
Adicione BSA em uma concentração final de 0,1% e armazene a menos 20 graus Celsius por até dois meses. Para purificar o BDNF, comece descongelando a mídia em um banho termoregulado Celsius de 37 graus. Em seguida, aliquotar a mídia em tubos centrífugas.
Centrífuga por uma hora a 3.500 g em uma centrífuga de ouro de quatro graus Celsius. Esta etapa permite a eliminação de detritos remanescentes para garantir o fluxo adequado através da coluna cromatografia. Em seguida, use os concentradores de proteína para reduzir a mídia de 500 mililitros para 100 mililitros.
Siga os parâmetros de centrifugação recomendados pelo fabricante para uma concentração ideal. Em seguida, adicione 500 microliters de níquel-NTA agarose contas à mídia concentrada e incubar durante a noite em um roqueiro a quatro graus Celsius. No dia seguinte, monte o aparelho de cromatografia e despeje a mídia nele.
Deixe descansar por cinco minutos e, em seguida, abra o galo de parada bidirecional para deixar o meio fluir. Lave com cinco mililitros de tampão de lavagem por cinco minutos, certificando-se de resuspensar as contas na coluna. Repita três vezes.
Por fim, adicione um mililitro de tampão de elução à coluna, certificando-se de resuspensar as contas. Incubar por 15 minutos e, em seguida, coletar o eluent em um tubo de microcentrífuga. Repita esta etapa três vezes para a elução completa do BDNF.
Para biotinilar o BDNF, pegue uma alíquota contendo 800 nanogramas da proteína e adicione o reagente tampão de biotinilação e, em seguida, um pouco de BirA-GST em uma relação molar um-para-um com bDNF. Incubar em forno de hibridização a 30 graus Celsius por 60 minutos, misturando o conteúdo do tubo a cada 15 minutos por inversão. Em seguida, adicione o mesmo volume de ATP e BirA-GST como na primeira etapa e incubar por 60 minutos, misturando o conteúdo do tubo a cada 15 minutos.
O BDNF biotinilado pode então ser deixado no gelo para verificação imediata de biotintilação ou armazenado a menos 80 graus Celsius para análise posterior. Para verificar a biotiningação do oviduto BDNF, comece bloqueando 30 microliters de contas magnéticas streptavidin por amostra BDNF em um buffer de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente por uma hora e, em seguida, precipitar as contas magnéticas em um separador de rack magnético e, em seguida, descartar o tampão de bloqueio.
Adicione 50 microliters de tampão de bloqueio fresco e a amostra BDNF às contas, certificando-se de resuspensá-los completamente. Homogeneize o conteúdo do tubo e incubar a quatro graus Celsius por uma hora em um rotador de tubo de microcentrifuagem. Prepare a amostra para a mancha ocidental, conforme descrito no texto para avaliar a eficiência da reação de biotintilação.
Para conjugar o oviduct BDNF aos pontos quânticos, comece adicionando o volume necessário de pontos quânticos para alcançar uma relação molar um-para-um com bDNF e, em seguida, diluir para um volume final de 20 microliters. Homogeneize o conteúdo do tubo e, em seguida, enrole-o em papel alumínio para protegê-lo da luz. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos em um roqueiro.
Em seguida, diluir o oviduto BDNF à concentração final desejada e adicioná-lo ao compartimento axonal de uma câmara microfluida, incubando por 210 minutos para imagens posteriores de células vivas ou fixas. O uso de um protocolo baseado em coluna de cromatografia permite o processamento de volumes significativos de mídia condicionada HEK293. Neste experimento, 500 mililitros de mídia condicionada foram processados para purificar oviduto BDNF.
Quatro eluções consecutivas com duração de 15 minutos cada renderam concentrações decrescentes de ovídeo BDNF variando de seis a 28 nanogramas por microliter. O rendimento total foi de aproximadamente 60 microgramas de oviduto BDNF. Este BDNF purificado foi então biotinilado por uma reação in vitro mediada por BirA-GST.
A amostra foi homogêneamente biotinilada como demonstrado pela falta de oviduto BDNF não biotinilado no supernante do tampão magnético limpo. Esses resultados mostram que o protocolo proposto permite a purificação de quantidades significativas de oviduto BDNF e mono-biotintilação in vitro. Em seguida, a atividade biológica do BDNF mono-biotinilado foi avaliada utilizando-se duas abordagens experimentais diferentes.
Primeiro, os neurônios corticais semeados em placas de 60 milímetros foram estimulados com 50 nanogramas por mililitro de BDNF monobiotinilado por 30 minutos e, em seguida, as proteínas foram preparadas para a análise de manchas ocidentais. A atividade biológica do BDNF mono-biotinilado foi quantificada pela detecção de fosfo-TrkB e fosfo-ERK. A vinculação de BDNF ao TrkB desencadeia a auto-fosforilação do receptor e a ativação de várias quinases a jusante, incluindo o ERK.
Uma condição de controle negativo que não foi estimulada com BDNF e uma condição de controle positiva que foi estimulada com BDNF comercialmente disponível foram incluídas para a análise da atividade biológica oviduct BDNF. As bandas eram ambas proteínas fosforiladas, tinham uma intensidade semelhante em neurônios tratados com BDNF comercial e BDNF mono-biotinilado, e ambas apresentaram um sinal mais forte do que a condição de controle negativo. Em seguida, a atividade biológica de BDNF mono-biotinilato acoplado a pontos quânticos streptavidin foi avaliada para demonstrar que eles podem ser usados em experimentos de imagem ao vivo.
Os neurônios corticais foram semeados em coberturas de 10 milímetros e tratados com uma concentração final de 200 picomolar ou dois pontos quânticos BDNF nanomolar por 30 minutos antes de fixar e coloração para phospho-CREB. CREB é um fator de transcrição que é alvo de ERK12 ativado em neurônios corticais. Estimular neurônios com concentrações crescentes de pontos quânticos BDNF resultou em um aumento dependente de dose de fosforilação do CREB e presença de partículas de pontos quânticos ao redor do núcleo indicando que as partículas de pontos quânticos BDNF foram endocitadas e desencadearam a ativação de vias de sinalização associadas à ativação TrkB mediada pelo BDNF.
Um aumento de duas vezes no sinal de fosfo-CREB foi detectado ao estimular neurônios com 200 pontos quânticos BDNF picomolares, enquanto estimular com dois pontos quânticos BDNF nanomolar resultou em um aumento de 3,5 vezes no sinal phospho-CREB. Portanto, o oviduto BDNF biotinilado é biologicamente ativo e não perde sua atividade quando acoplado a pontos quânticos streptavidin tornando-o adequado para imunofluorescência e imagem de células vivas. Finalmente, o potencial de imagem dos pontos quânticos BDNF foi avaliado em culturas compartimentadas utilizando câmaras microfluidas.
Os neurônios corticais foram semeados em câmaras microfluidas para separar os compartimentos axonal e somatodendritic e foram estimulados com dois pontos quânticos BDNF nanomolar por 3,5 horas. A microscopia de células vivas foi realizada e os kymógrafos resultantes foram usados para quantificar a velocidade do ponto quântico BDNF contendo organelas. Foi detectada uma velocidade móvel média de 0,91 micrômetros por segundo, em consonância com a análise prévia do transporte mediado por timina citoplasmática.
Câmaras microfluidas tratadas com dois pontos quânticos nanomolar streptavidin não mostraram pontos quânticos em movimento nos micro grupos, como mostrado pelo kymograph. As células cultivadas sob as mesmas condições foram estimuladas com 500 picomolar ou dois pontos quânticos BDNF nanomolar por 210 minutos e depois fixadas e rotuladas com uma mancha nuclear. Os neurônios tratados com pontos quânticos BDNF mostram um acúmulo dependente de dose da proteína rotulada em todos os subcomentamentos analisados, incluindo as porções proximais e distais do micro grupo e o compartimento somatodendritico.
Em contraste, os neurônios de controle não mostraram quase nenhum sinal de ponto quântico em toda a câmara. Portanto, o ponto quântico BDNF pode ser detectado em células vivas e fixas em câmaras microfluidas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir bdnf mono-biotiningado oviduct em um procedimento econômico baseado em coluna de cromatografia.
