Bu işlemin genel amacı, HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu ve kromatografi kolonunda saflaştırmayı içeren optimize edilmiş bir protokolde BDNF oviduct üretmek ve arındırmaktır. BDNF oviduct sonra floresan mikroskopi ile posterior etiketleme ve algılama için bir in vitro reaksiyon ile mono-biyotinylated olduğunu. Bu işlemin en büyük avantajı, BDNF'nin en iyi şekilde üretilmesine, arıtılmasına ve mono-biyotinylasyonuna olanak sağlamasıdır.
Gebelik parametreleri uygun maliyetli transfeksiyon reaktifi kullanılarak maksimum BDNF üretimi için optimize edilmiş ve arıtma işlemi manipülasyonu kolaylaştıran ve prosedürü nisbeten tırmandırmaya olanak sağlayan bir kromatografi kurulumunda gerçekleştirilmiştir. 60 mikrogram polietilenin 500 mikrolitre ekilmemiş DMEM ve 20 mikrogram BDNF oviduct plazmid 500 mikrolitre takviyesiz DMEM 15 santimetre lik çanak başına seyreltilerek başlayın. Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatın ve dna çözeltisini dikkatlice bir polietilenin tüpüne inceleyerek yukarı/aşağı hareketle karıştırın.
Oda sıcaklığında 25 dakika kuluçkaya yatın ve her 15 santimetrelik çanak boyunca bir mililitre PEI/DNA karışımı damlatın. Hücreleri PEI/DNA karışımıile üç saat kuluçkaya yatırın ve sonra orta yı kuluçka tamponuna çevirin. Hücrelerin transfeksiyon sonra 48 saat, tüm yemeklerden orta toplamak.
Daha sonra Sodyum klorür, fosfat tamponlu bileşenler, imidazol ve proteaz inhibitörleri de dahil olmak üzere HEK293 supernatant BDNF orta bileşenleri ekleyin. 15 dakika buzda kuluçkaya yat. Sonra santrifüj tüpler içine orta aliquot.
Santrifüj 45 dakika 10, 000 g dört derece santigrat altın santrifüj. Bu adım, medyada asılı hücre enkaz ve ölü hücrelerin ortadan kaldırılmasına olanak sağlar. Sonra supernatants toplamak.
%0,1'lik son konsantrasyonda BSA'yı ekleyin ve iki aya kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. BDNF arındırmak için, 37 derece Santigrat termik düzenlenmiş banyoda medya çözülerek başlar. Sonra santrifüj tüpler içine medya aliquot.
Santrifüj bir saat için 3, 500 g dört derece santigrat altın santrifüj. Bu adım, kromatografi sütunu ile yeterli akışı sağlamak için kalan enkaz ortadan kaldırılmasısağlar. Daha sonra 500 mililitreden 100 mililitreye kadar ortamı azaltmak için protein konsantratörlerini kullanın.
Optimum konsantrasyon için üreticinin önerilen santrifüj parametrelerini uygulayın. Sonra konsantre ortama 500 mikrolitre nikel-NTA agarose boncuk ekleyin ve dört santigrat derecede bir rocker gecede kuluçka. Ertesi gün, kromatografi cihazını monte edin ve içine ortam dökün.
Beş dakika dinlendirin ve sonra orta akmasını sağlamak için iki yönlü stop horoz açın. Beş mililitre yıkama tamponu ile beş dakika boyunca yıkayın ve sütundaki boncukları yeniden askıya alın. Üç kez tekrarlayın.
Son olarak, boncukları yeniden askıya almak için emin olmak için sütuna bir mililitre elution arabellek ekleyin. 15 dakika kuluçka ve sonra bir mikrosantrifüj tüp eluent toplamak. BDNF tam elution için bu adımı üç kez tekrarlayın.
BDNF biyotinylate için, protein 800 nanogram içeren bir aliquot almak ve biyotinylation tampon reaktif ve daha sonra BDNF ile bire bir molar ilişki içinde bazı BirA-GST ekleyin. 30 santigrat derecede 60 dakika boyunca bir melezleme fırında kuluçka, tüp içeriğini karıştırma her 15 dakikada bir ters tarafından. Daha sonra ilk adımda olduğu gibi ATP ve BirA-GST aynı hacmi ekleyin ve 60 dakika kuluçka, her 15 dakikada tüp içeriğini karıştırma.
Biyotinylated BDNF sonra hemen biyotinylation doğrulama için buz içinde bırakılabilir veya posterior analizi için eksi 80 santigrat derece saklanabilir. BDNF oviduct biyotinylation doğrulamak için, bir engelleme tampon BDNF örnek başına streptavidin manyetik boncuk 30 mikrolitre bloke ederek başlar. Bir saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka ve sonra manyetik raf ayırıcı manyetik boncuk çöktürün ve sonra engelleme tampon atın.
Boncuklara 50 mikrolitre taze engelleme tamponu ve BDNF örneğini ekleyerek tamamen askıya alın. Bir mikrosantrifüj tüp rotator bir saat boyunca dört derece santigrat tüp içeriğini homojenize ve kuluçka. Biyotinylasyon reaksiyonunun etkinliğini değerlendirmek için metinde açıklandığı gibi batı lekeleme için örnek hazırlayın.
BDNF oviduct'i kuantum noktalarına eşlemek için, BDNF ile bire bir molar ilişkisi elde etmek ve ardından 20 mikrolitrelik son bir hacimle seyreltmek için kuantum noktalarının gerekli hacmini ekleyerek başlayın. Tüpün içeriğini homojenize ve daha sonra ışıktan korumak için alüminyum folyo sarın. Bir rocker 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
Daha sonra BDNF oviduct'i istenilen son konsantrasyona seyreltin ve mikroakışkan bir odanın aksonal bölmesine ekleyin, posterior canlı veya sabit hücre görüntülemesi için 210 dakika kuluçkaya yatırın. Kromatografi kolon tabanlı protokolün kullanılması, önemli hacimlerde HEK293 şartlı ortam işlenmesine olanak sağlar. Bu deneyde, 500 mililitre klimalı ortam BDNF oviduct arındırmak için işlenmiştir.
Her biri 15 dakika süren dört ardışık elutions mikrolitre başına altı ila 28 nanogram arasında değişen BDNF oviduct konsantrasyonları azalan verdi. Toplam verim bdnf oviduct yaklaşık 60 mikrogram olarak hesaplandı. Bu saflaştırılmış BDNF daha sonra BirA-GST aracılığında bir in vitro reaksiyon tarafından biyotinylated oldu.
Örnek, manyetik boncuk temizlenmiş tamponun süpernatantında biyotinylated olmayan BDNF oviduct eksikliğinden de anlaşıldığı gibi homojen bir şekilde biyotinylated edildi. Bu sonuçlar, önerilen protokolün önemli miktarda BDNF oviduct ve homojen in vitro mono-biyotinylation saflaştırma sağlar göstermektedir. Daha sonra mono-biyotinylated BDNF biyolojik aktivitesi iki farklı deneysel yaklaşımlar kullanılarak değerlendirildi.
İlk olarak, 60 milimetrelik plakalarda tohumlanan kortikal nöronlar mililitrede 50 nanogram mono-biyotinylated BDNF ile 30 dakika süreyle uyarıldı ve daha sonra proteinler batı leke analizi için hazırlandı. Mono-biyotinylated BDNF biyolojik aktivitesi fosfo-TrkB ve fosfo-ERK saptanarak ölçüldü. BDNF'nin TrkB'ye bağlanması reseptörün otofosforilasyonunu ve ERK dahil olmak üzere birçok downstream kinazının aktivasyonunu tetikler.
BDNF ile uyarılamayan negatif kontrol durumu ve ticari olarak mevcut BDNF ile uyarılan pozitif kontrol koşulu BDNF oviduct biyolojik aktivitesinin analizine dahil edildi. Bantlar her ikisi de fosforilasyon proteinleri vardı, ticari BDNF ve mono-biyotinylated BDNF ile tedavi nöronlarda benzer bir yoğunluk vardı, ve her ikisi de negatif kontrol durumu daha güçlü bir sinyal gösterdi. Daha sonra mono-biyotinylated BDNF biyolojik aktivitesi streptavidin kuantum nokta ile birleştiğinde canlı görüntüleme deneylerinde kullanılabilir olduğunu göstermek için değerlendirildi.
Kortikal nöronlar 10 milimetrelik kapaklarda tohumlandı ve fosfo-CREB için sabitleme ve boyama dan önce 30 dakika boyunca 200 picomolar veya iki nanomolar BDNF kuantum nokta son konsantrasyonu ile tedavi edildi. CREB kortikal nöronlarda aktive ERK12 tarafından hedeflenen bir transkripsiyon faktörüdür. BDNF kuantum noktalarının artan konsantrasyonları ile nöronlar uyarıcı CREB fosforilasyon ve BDNF kuantum nokta parçacıkları endocytosed olduğunu belirten çekirdek çevreleyen kuantum nokta parçacıkların varlığı doza bağlı artış ile sonuçlandı ve BDNF aracılı TrkB aktivasyonu ile ilişkili sinyal yollarının aktivasyonunu tetikledi.
Fosfo-CREB sinyalinde iki kat artış 200 picomolar BDNF kuantum noktalı nöronları uyarırken, iki nanomolar BDNF kuantum noktalarıyla uyarıcı uyarıcı fosfo-CREB sinyalinde 3.5 kat artış alameti saptanır. Bu nedenle, biyotinylated BDNF oviduct biyolojik olarak aktif ve streptavidin kuantum nokta ile birleştiğinde immünoresans ve canlı hücre görüntüleme için uygun hale aktivitesini kaybetmez. Son olarak, BDNF kuantum noktalarının görüntüleme potansiyeli mikroakışkan bölmeler kullanılarak kompartalize kültürlerde değerlendirildi.
Kortikal nöronlar aksonal ve somatodendritik bölmeleri ayırmak için mikroakışkan odalarda tohumlanmış ve 3.5 saat boyunca iki nanomolar BDNF kuantum nokta ile uyarılmış. Canlı hücre mikroskobu yapıldı ve ortaya çıkan kymograflar organel içeren BDNF kuantum noktahızını ölçmek için kullanıldı. Saniyede ortalama 0,91 mikrometre hareket hızı tespit edildi ve bu da sitoplazmik timin aracılı taşımanın önceki analizine uygun olarak saptandı.
İki nanomolar streptavidin kuantum noktaile tedavi edilen mikroakışkan bölmeler, kymografın gösterdiği gibi mikro gruplarda hareketli kuantum noktalarını göstermedi. Aynı koşullar altında yetiştirilen hücreler 210 dakika boyunca 500 pikomolar veya iki nanomolar BDNF kuantum nokta ile uyarıldı ve daha sonra sabit ve bir nükleer leke ile etiketlendi. BDNF kuantum noktalarıyla tedavi edilen nöronlar, mikro grubun proksimal ve distal kısımları ve somatodendritik kompartman da dahil olmak üzere analiz edilen tüm alt bölümlerde etiketlenmiş proteinin doza bağlı birikmesini göstermektedir.
Buna karşılık, kontrol nöronlar oda boyunca hemen hemen hiç kuantum nokta sinyali gösterdi. Bu nedenle, BDNF kuantum nokta mikroakışkan odalarında canlı ve sabit hücrelerde tespit edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kromatografi kolon tabanlı maliyet etkin prosedüründe mono-biyotinylated BDNF oviduct üretmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
