이 절차의 전반적인 목표는 HEK293 세포의 트랜스퍼와 크로마토그래피 컬럼의 정화와 관련된 최적화된 프로토콜에서 BDNF oviduct를 생산하고 정화하는 것입니다. BDNF oviduct는 그 때 형광 현미경 검사법에 의하여 후방 표지 및 검출을 위한 체외 반응에 의해 mono-biotinylated됩니다. 이 절차의 주요 장점은 최적화된 방식으로 BDNF의 생산, 정제 및 모노 바이오타이니션을 허용한다는 것입니다.
임신 매개 변수는 비용 효율적인 트랜스페트 시약을 사용하여 최대 BDNF 생산에 최적화되었으며, 정제 공정은 조작을 용이하게 하고 절차를 확대할 수 있는 크로마토그래피 설정에서 수행된다. 비보충 DMEM의 500 마이크로리터와 15센티미터 당 보충되지 않은 DMEM의 500 마이크로리터에서 20 마이크로그램의 폴리에틸렌닌 60 마이크로그램을 희석하여 시작합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 DNA 용액을 폴리에틸렌광 튜브로 조심스럽게 피펫하여 위아래로 움직이면 한 번 섞습니다.
실온에서 25분 동안 배양한 다음 각 15센티미터 접시에 PEI/DNA 혼합물1밀리리터를 드립합니다. PEI/DNA 혼합물로 세포를 3시간 동안 배양한 다음 배지를 인큐베이션 버퍼로 변경합니다. 세포의 전환 후 48 시간, 모든 접시에서 매체를 수집합니다.
그런 다음 염화나트륨, 인산염 완충 성분, 이미다졸 및 프로테아제 억제제를 포함한 HEK293 상퍼나탄에 BDNF 배지 성분을 첨가한다. 15분 동안 얼음으로 배양하세요. 그런 다음 배지를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.
원심분리기는 섭씨 10, 000g에서 45분간 4도의 금 원심분리기. 이 단계는 매체에 매달린 세포 파편과 죽은 세포의 제거를 허용합니다. 그런 다음 초월체를 수집합니다.
BSA를 0.1%의 최종 농도로 추가하고 최대 2개월 동안 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. BDNF를 정화하려면 37도 의 온도 조절 된 욕조에서 미디어를 해동하십시오. 그런 다음 미디어를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.
원심분리기는 섭씨 3도, 500g에서 1시간 동안 4도 의 금 원심분리기. 이 단계를 통해 남은 파편을 제거하여 크로마토그래피 컬럼을 통과하는 적절한 흐름을 보장할 수 있습니다. 그런 다음 단백질 농축기를 사용하여 미디어를 500 밀리리터에서 100 밀리리터로 줄입니다.
최적의 농도를 위해 제조업체에서 권장하는 원심분리 매개 변수를 따르십시오. 그런 다음 500 마이크로리터의 니켈-NTA 아가로즈 구슬을 농축 된 미디어에 추가하고 섭씨 4도의 로커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 크로마토그래피 장치를 조립하고 미디어를 부어 넣습니다.
5 분 동안 휴식을 취한 다음 양방향 스톱 콕을 열어 중간 이쪽으로 흐르게하십시오. 5 밀리리터의 워시 버퍼로 5분간 세척하여 열의 구슬을 다시 보재하십시오. 세 번 반복합니다.
마지막으로 열에 용출 버퍼 1밀리리터를 추가하여 구슬을 다시 일시 중지합니다. 15분 동안 배양한 다음 마이크로센심분리기 튜브에서 용액을 수집합니다. BDNF의 완전한 용출을 위해 이 단계를 세 번 반복합니다.
BDNF를 생체화하기 위해 단백질 800 나노그램을 함유한 알리쿼트(aliquot)를 복용하고 생체자극완약 시약을 추가한 다음 BDNF와의 일대일 어금니언 관계에서 BirA-GST를 추가합니다. 혼성화 오븐에서 60분간 30도의 혼합 오븐에서 인큐베이션하여 15분마다 튜브의 내용이 반전으로 혼합됩니다. 그런 다음 첫 번째 단계에서와 동일한 양의 ATP 및 BirA-GST를 추가하고 60 분 동안 배양하여 15 분마다 튜브의 내용을 혼합합니다.
생체 화 BDNF는 즉각적인 생체 자극 확인을 위해 얼음에 남아 있거나 후방 분석을 위해 영하 80도에 보관될 수 있습니다. BDNF oviduct의 생체 자극을 확인하려면 블로킹 버퍼에서 BDNF 샘플 당 스트렙타비딘 자기 비드 30 마이크로리터를 차단하는 것으로 시작합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 마그네틱 랙 분리기에서 마그네틱 구슬을 침전한 다음 차단 버퍼를 폐기합니다.
50마이크로리터의 신선한 블로킹 버퍼와 BDNF 샘플을 구슬에 추가하여 완전히 다시 중단합니다. 튜브의 내용을 균질화하고 마이크로 센드심분리기 튜브 회전기에서 1 시간 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오. 생체 자극 반응의 효율을 평가하기 위해 텍스트에 설명된 바와 같이 서부 블로팅샘플을 준비한다.
BDNF oviducts를 퀀텀닷에 수렴하려면 BDNF에 일대일 어금니관계를 달성한 다음 최종 20마이크로리터로 희석하기 위해 필요한 퀀텀닷 부피를 추가하는 것으로 시작합니다. 튜브의 내용체를 균질화한 다음 알루미늄 호일로 감싸빛으로부터 보호합니다. 로커에서 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
그런 다음 BDNF oviduct를 원하는 최종 농도로 희석시키고 미세 유체 챔버의 축산구에 추가하여 후방 라이브 또는 고정 된 세포 이미징을 위해 210 분 동안 배양합니다. 크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜을 사용하면 상당한 양의 HEK293 조건부 미디어를 처리할 수 있습니다. 이 실험에서는 BDNF oviduct를 정화하기 위해 500 밀리리터의 조건부 미디어가 처리되었습니다.
4연속 은출은 각각 15분 동안 지속되는 것으로, 마이크로리터당 6~28나노그램에 이르는 BDNF oviduct의 농도가 감소했습니다. 총 수율은 BDNF oviduct의 약 60 마이크로그램에 달했습니다. 이 정제 된 BDNF는 BirA-GST에 의해 중재 된 체외 반응에 의해 생체 화되었다.
이 샘플은 자기 비드 클리어 버퍼의 상퍼중비 생체화 BDNF oviduct의 부족에 의해 입증된 바와 같이 균질하게 바이오티니드하였다. 이러한 결과는 제안된 프로토콜이 생체외 모노 바이오타이니션에서 상당한 양의 BDNF oviduct 및 균질성 정제를 허용한다는 것을 보여줍니다. 이어서 모노바이오티니화 BDNF의 생물학적 활성은 2개의 상이한 실험접근법을 사용하여 평가하였다.
첫째, 60mm 플레이트에서 시드된 피질 뉴런은 30분 동안 모노 바이오티니드 BDNF의 밀리리터당 50나노그램으로 자극된 다음 단백질은 서부 얼룩 분석을 위해 제조되었다. 모노 바이오티니징 BDNF의 생물학적 활성은 인-트rkB 및 인-ERK를 검출함으로써 정량화되었다. TrkB에 BDNF의 결합은 ERK를 포함하는 몇몇 다운스트림 키나아제의 수용체의 자동 인산화 및 활성화를 트리거합니다.
BDNF로 자극되지 않은 부정적인 대조 조건과 BDNF로 자극된 양성 조절 조건이 BDNF oviduct 생물학적 활성의 분석을 위해 포함되었다. 밴드는 모두 인계 단백질이었고, 상업용 BDNF 및 모노 바이오티니화 BDNF로 치료된 뉴런에서 비슷한 강도를 보였으며, 둘 다 부정적인 대조군 조건보다 더 강한 신호를 보였다. 이어서 연쇄상구균점에 결합된 모노바이오티니화 BDNF의 생물학적 활성은 살아있는 이미징 실험에서 사용될 수 있음을 입증하기 위해 평가되었다.
피질 뉴런은 10mm 커버로 시드되었고, 인-CREB를 고정하고 염색하기 전에 30분 동안 200피코몰러 또는 2개의 나노몰라 BDNF 양자점의 최종 농도로 처리하였다. CREB는 피질 뉴런에서 활성화된 ERK12에 의해 표적으로 하는 전사 인자입니다. BDNF 양자점의 농도가 증가함에 따라 신경세포를 자극하여 CREB의 인산화용량 증가와 핵을 둘러싼 양자점 입자의 존재는 BDNF 양자점 입자가 내분비화되어 BDNF 매개 TrkB와 관련된 신호 경로의 활성화를 촉발시켰다.
200피코모라 BDNF 양자점으로 신경을 자극하는 반면, 2나노몰러 BDNF 양자점으로 자극하는 반면, 인-CREB 신호의 2배 증가가 인-CREB 신호의 3.5배 증가를 초래했다. 따라서, 생체화 된 BDNF oviduct는 생물학적으로 활성화되고 면역 형광 및 살아있는 세포 이미징에 적합한 streptavidin 양자점에 결합할 때 그 활동을 잃지 않습니다. 마지막으로, BDNF 양자점의 이미징 잠재력은 미세유체 챔버를 사용하여 구획화된 배양에서 평가되었다.
피질 뉴런은 축산 및 소종 절인 구획을 분리하기 위해 미세 유체 챔버에서 시드되었으며 3.5 시간 동안 두 개의 나노 몰러 BDNF 양자점으로 자극되었습니다. 살아있는 세포 현미경 검사가 수행되었고, 결과 kymographs는 세포기관을 포함하는 BDNF 양자점의 속도를 정량화하기 위하여 이용되었습니다. 초당 0.91 마이크로미터의 평균 이동 속도가 검출되었으며, 이는 세포질 흉포 성 흉포 매개 수송의 이전 분석과 일치합니다.
2개의 나노몰러 스트렙타비딘 양자점으로 취급된 미세유체 챔버는 kymograph에 의해 도시된 것과 같이 마이크로 단에 있는 움직이는 양자점을 보여주지 않았습니다. 동일한 조건하에서 자란 세포는 500 피코몰라 또는 2나노몰라 BDNF 양자점으로 210분 동안 자극한 다음 핵 얼룩으로 고정및 표지하였다. BDNF 양자점으로 처리된 뉴런은 마이크로 그룹과 소마토덴드리틱 구획의 근해 및 탈모 부분을 포함하여 모든 분석된 하위 구획에서 표지된 단백질의 용량 의존적 축적을 보여준다.
대조적으로, 제어 뉴런은 챔버 전체에 거의 양자 점 신호를 보여주지 않았다. 따라서, BDNF 양자점은 미세 유체 챔버에서 라이브 및 고정 세포에서 검출될 수 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 크로마토그래피 컬럼 기반 비용 효율적인 절차에서 모노 바이오타이니드 BDNF oviduct를 생산하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다.
