この手順の全体的な目標は、HEK293細胞のトランスフェクションとクロマトグラフィーカラムでの精製を含む最適化されたプロトコルでBDNFオビダクトを生成し、精製することです。BDNFの卵管は、蛍光顕微鏡による後部標識および検出のためのインビトロ反応によって単一ビオチン化される。この手順の主な利点は、BDNFの生産、精製、および単一バイオチン化を最適化された方法で可能にすることです。
この妊娠パラメータは、費用対効果の高いトランスフェクション試薬を使用して最大BDNF産生に最適化されており、精製プロセスは、操作を容易にし、手順をエスカレートすることを可能にするクロマトグラフィー設定で行われます。500マイクロリットルの未補充DMEMで60マイクログラムのポリエチレンニミンを希釈し、BDNFオビダクトプラスミド20マイクログラムを15センチメートル皿当たり500マイクロリットルの未補充DMEMで希釈してトランスフェクションします。室温で5分間インキュベートし、DNA溶液をポリエチレンミミンチューブに慎重にピペットし、上下運動で1回混合します。
室温で25分間インキュベートし、各15センチメートルの皿全体でPEI / DNA混合物の1ミリリットルを滴下します。PEI/DNA混合物で細胞を3時間インキュベートし、培地をインキュベーションバッファーに変更します。細胞のトランスフェクションの48時間後、すべての皿から培地を集める。
次に、塩化ナトリウム、リン酸緩衝成分、イミダゾール、プロテアーゼ阻害剤を含むHEK293上清にBDNF培地成分を添加する。氷で15分間インキュベートします。その後、遠心分離管に媒体をアリクォート。
4°Cの金遠心分離機で10,000gで45分間遠心分離機。このステップは、培地に懸濁した細胞デブリおよび死細胞の除去を可能にする。その後、上清を収集します。
最終濃度0.1%でBSAを追加し、マイナス20度で最大2ヶ月間保存します。BDNFを浄化するには、37°Cの熱調節浴で媒体を解凍することから始めます。その後、遠心分離管にメディアをアリクォート。
4度の金遠心分離機で3、500gで1時間の遠心分離機。このステップはクロマトグラフィーコラムを通る十分な流れを保障するために残りの破片の除去を可能にする。その後、タンパク質濃縮器を使用して、培地を500ミリリットルから100ミリリットルに減らします。
最適な濃度を得るための、メーカーの推奨遠心調整パラメータに従ってください。その後、濃縮培地にニッケルNTAアガロースビーズの500マイクロリットルを追加し、摂氏4度でロッカーに一晩インキュベートします。翌日、クロマトグラフィー装置を組み立て、媒体を注ぎ込みます。
5分間休ませてから、双方向の停止コックを開けて、中程度の流れを通します。5ミリリットルの洗浄バッファーで5分間洗浄し、カラム内のビーズを再中断してください。3 回繰り返します。
最後に、ビーズを再中断するようにカラムに溶出バッファーを1ミリリットル追加します。15分間インキュベートし、マイクロ遠心チューブに溶出物を集めます。BDNF の完全な溶出のためにこのステップを 3 回繰り返します。
BDNFをビオチン化するには、800ナノグラムのタンパク質を含むアリコートを取り、ビオチン化緩衝試薬を加え、その後、BDNFと1対1のモル関係でBirA-GSTを加えます。30°Cで60分間ハイブリダイゼーションオーブンでインキュベートし、反転によって15分ごとにチューブの内容物を混合します。次に、最初のステップと同じ量のATPとBirA-GSTを加え、60分間インキュベートし、チューブの内容物を15分ごとに混合します。
ビオチン化されたBDNFは、即座にビオチン化検証のために氷の中に残すか、後部分析のためにマイナス80°Cで保存することができます。BDNFのオビチン化を確認するために、まず、BDNFサンプル当たり30マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズをブロッキングバッファーで遮断します。室温で1時間インキュベートし、磁気ビーズを磁気ラック分離器に沈殿させ、ブロッキングバッファを廃棄します。
50マイクロリットルの新鮮なブロッキングバッファーとBDNFサンプルをビーズに加え、完全に再中断してください。チューブの内容物を均質化し、マイクロ遠心チューブローテーターで1時間摂氏4度でインキュベートします。バイオチン化反応の効率を評価するために、テキストに記載されているように、ウェスタンブロッティング用のサンプルを準備します。
BDNFの卵管を量子ドットに結合するには、まず、BDNFとの1対1のモル関係を達成するために必要な量の量子ドットを加え、最終的な体積20マイクロリットルに希釈します。チューブの内容物を均質化し、それをアルミニウム箔で包んで光から保護します。ロッカーで30分間室温でインキュベートします。
次に、BDNF卵管を所望の最終濃度に希釈し、マイクロ流体室の軸索室に加え、後生細胞または固定細胞イメージングのために210分間インキュベートする。クロマトグラフィーカラムベースのプロトコルを使用することで、HEK293コンディションメディアの大量処理が可能になります。本実験では、500ミリリットルの調整された培地を処理してBDNFの卵管を精製した。
15分間続く4つの連続した溶出は、マイクロリットル当たり6〜28ナノグラムのBDNF排卵の濃度を減少させた。総収量は約60マイクログラムのBDNFオビダクトに相当した。この精製されたBDNFは、その後、BirA-GSTによって媒介されたインビトロ反応によってビオチン化された。
このサンプルは、磁気ビーズクリアバッファーの上清における非ビオチン化BDNFオビダクトの欠如によって示されるように均質にビオチン化した。これらの結果は、提案されたプロトコルが大量のBDNFオビダクトおよび均質なインビオトロモノビオチン化の精製を可能にすることを示す。次に、モノビオチン化BDNFの生物活性を、2つの異なる実験アプローチを用いて評価した。
まず、60ミリメートルプレートに播種した皮質ニューロンを、1ミリリットル当たり50ナノグラムの単酸ビチン化BDNFで30分間刺激し、次にウェスタンブロット分析のためにタンパク質を調製した。モノビチン化BDNFの生物活性を、ホスホ-TrkBおよびホスホ-ERKを検出することによって定量化した。TrkBへのBDNFの結合は、受容体の自動リン酸化およびERKを含むいくつかの下流キナーゼの活性化を引き起こす。
BDNFで刺激されなかった陰性対照条件と、市販のBDNFで刺激された陽性対照条件をBDNFの生物活性の解析に含めた。バンドは両方ともリン酸化タンパク質であり、市販のBDNFおよびモノビオチン化BDNFで処理されたニューロンにおいて同様の強度を有し、両方とも陰性対照条件よりも強いシグナルを示した。次に、モノビオチン化BDNFの生物活性をストレプトアビジン量子ドットに結合し、それらがライブイメージング実験で使用できることを実証するために評価した。
皮質ニューロンを10ミリメートルのカバーに播種し、200ピコモルまたは2ナノモルBDNF量子ドットの最終濃度で30分間処理した後、ホスホ-CREBの固定と染色を行った。CREBは、皮質ニューロンにおける活性化ERK12によって標的とされる転写因子である。BDNF量子ドットの濃度が増加すると刺激ニューロンは、CREBのリン酸化の用量依存的な増加をもたらし、核を取り囲む量子ドット粒子の存在は、BDNF量子ドット粒子がエンドサイトース化され、BDNF媒介性TrkB活性化に関連するシグナル伝達経路の活性化を引き起こしたことを示した。
200個のピコモラルBDNF量子ドットでニューロンを刺激すると2倍の増加が検出され、ナノモルBDNF量子ドットで刺激すると、ホスホ-CREB信号が3.5倍増加しました。したがって、ビオチン化されたBDNFの卵管は生物学的に活性であり、ストレプトアビジン量子ドットに結合しても活性を失わないため、免疫蛍光および生細胞イメージングに適しています。最後に、BDNF量子ドットのイメージング電位を、マイクロ流体室を用いた区画化培養で評価した。
皮質ニューロンは、軸索および体性樹状コンパートメントを分離するために微小流体室に播種し、2つのナノモルBDNF量子ドットで3.5時間刺激された。生細胞顕微鏡を行い、その結果、ビモグラフを使用して、オルガネラを含むBDNF量子ドットの速度を定量化した。1秒間に平均移動速度0.91マイクロメートルが検出され、細胞質チミン媒介輸送の以前の分析に沿ったものである。
2つのナノモルストレプトアビジン量子ドットで処理されたマイクロ流体室は、キモグラフが示すように、マイクログループ内の量子ドットの移動を示さなかった。同じ条件で増殖した細胞を、500個のピコモルまたは2つのナノモルBDNF量子ドットで210分間刺激し、次いで核染色で固定および標識した。BDNF量子ドットで処理されたニューロンは、マイクログループの近位および遠位部分および体性樹状コンパートメントを含む分析されたすべてのサブコンパートメントにおける標識タンパク質の用量依存的蓄積を示す。
対照的に、制御ニューロンはチャンバー全体に量子ドット信号をほとんど示さなかった。従って、BDNF量子ドットは、マイクロ流体室内の生細胞および固定細胞で検出することができる。このビデオを見た後、クロマトグラフィーカラムベースの費用対効果の高い手順でモノビチン化BDNFオビダクトを生成する方法をよく理解する必要があります。
