Динамическое зажим может модифицировать или вводить любой мембранный ток в нейрон. Мы вводим и модифицируем натриевый калиевый насос и постоянный ток натрия в живой сердечный интернейрон пиявки. Использование динамической лампы позволяет с помощью нажатия клавиши управлять динамикой и амплитудой любого тока, вводимого в нейрон в режиме реального времени.
Разработка интерактивных систем реального времени, таких как динамический зажим, лежит в основе всех исследований ИМТ. Все аспекты клеточных исследований электрической активности нейронов и сетей потенциально могут извлечь выгоду из использования динамического зажима. Основными задачами этого метода являются разработка моделей в реальном времени в нейроне и калибровка динамических корректировок судорог для нейрона, выбранного для исследования.
Для выделения ганглия 7 из нервного канатика пиявки заполните черную смоляную линию рассекающей посуды примерно одним сантиметром охлажденного физиологического раствора, дополненного хлоридом натрия, хлоридом калия, хлоридом кальция, D-глюкозой и HEPES в деионизированной воде и приколоть холодную анестезированную пиявку спинной стороной вверх в камере. Используйте стереомикроскоп с 20-кратным увеличением с наклонной подсветкой световода и пятимиллиметровыми пружинными ножницами, чтобы сделать продольный разрез длиной не менее трех сантиметров через стенку тела в ростральной третьей части тела. Используйте штифты, чтобы раздвинуть ткань стенки тела, чтобы обнажить внутренние органы и пропылесосить кровь, чтобы получить лучший обзор.
Выделяют отдельный ганглий среднего тела 7. Используя резкие щипцы с номером пять, чтобы помочь направить разрезание и удерживать синус, используйте ножницы, чтобы открыть синус, в котором находится нервный канаповина, заботясь о том, чтобы разделить синус дорсально и вентрально. Сохраняя синус прикрепленным к каждому из двух двусторонних нервных корешков, которые выходят из ганглия, разрезайте ростральные и хвостовые соединительные нервные пучки, чтобы удалить ганглий из тела и разрезать корешки латерально туда, где они выходят из пазухи.
Используйте старые притупленные щипцы номер пять, чтобы закрепить полоски пазух и рыхлую ткань с помощью укороченного штифта насекомых Minutien вентральной стороной вверх в прозрачных смоляных чашках Петри. Прикрепите ростральные и каудальные соединения как можно дальше от ганглия и надежно закрепите корни. Увеличьте увеличение стереомикроскопа до 40X или более и отрегулируйте косое освещение таким образом, чтобы тела нейронных клеток можно было легко наблюдать на вентральной стороне ганглия чуть ниже периневриума.
Используя микроножники, начните разрезать свободную мононеальную оболочку между корнями с одной стороны ганглия, продолжая разрез сбоку с другой стороны и следя за тем, чтобы лезвие ножниц было поверхностным, не повреждая тела нейрональных клеток непосредственно под оболочкой. Сделайте аналогичный поверхностный срез каудально из бокового разреза вдоль средней линии и используйте тонкие щипцы номер пять, чтобы оттянуть один хвостовой боковой лоскут оболочки от ганглия за раз, чтобы каждый из них был иссекен. Когда оба клапана были удалены, оба интернейрона сердца должны быть обнажены.
Поместите блюдо в записывающее строю и наполняйте образец физиологическим раствором со скоростью потока пять миллилитров в минуту при комнатной температуре. Чтобы идентифицировать интернейроны на записывающей установке, выберите увеличение от 50 до 100X с подсветкой темного поля ниже и найдите нейрон HN 7 двусторонней пары по его каноническому расположению в заднеположном положении в середине ганглия тела 7. Затем используйте микро-манипулятор для размещения острого микроэлектрода, заполненного двумя молярными ацетатом калия и 20-миллимолярным микроэлектродом хлорида калия, очень близко к телу целевой ячейки, и используйте нейрофизиологический электрометр для непрерывного наблюдения зарегистрированного потенциала.
Установите этот потенциал на ноль милливольт и проникните в нейрон с помощью микроэлектрода, используя манипулятор, чтобы медленно вести электрод вдоль его длинной оси. Используйте 100-миллисекундную функцию жужжания электрометра до тех пор, пока не будет наблюдаться отрицательный сдвиг мембранного потенциала и активная пиковая активность. Установите электрометр на не менее трех килогерц в режиме прерывистого тока, чтобы одновременно регистрировать мембранный потенциал при прохождении тока к нейрону.
Используйте осциллограф для контроля настройки электрода и используйте инжектор постоянного тока для введения постоянного тока минус 0,1 наноампер в течение одной-двух минут для стабилизации записи. Нейрон HN 7 можно идентифицировать по характерной форме шипа и слабой раскрепощающей активности. Для динамической проводимости зажима и реализации тока откройте программное обеспечение динамического зажима, специально созданное для платы цифровой обработки сигналов.
И пока модель работает, установите максимальный ток насоса на 0,1-0,2 наноампер и постепенно увеличивайте максимальную проводимость постоянного тока натрия до тех пор, пока не последует регулярный разрыв. Систематически сообразовывайте эти токи с шагом 0,1 наноампер для максимальной выходной мощности тока насоса и приращениями в один нанозименс для максимальной проводимости постоянного тока натрия и оценивайте влияние этих увеличений на частоту всплеска, интервал между всплесками, продолжительность всплеска и период всплеска. Удерживайте максимальную проводимость тока натрия при определенном фиксированном значении и развертывайте с шагом в один наноамп в диапазоне максимальных токов насоса для поддержки регулярной активности разрыва до увеличения фиксированного значения проводимости натрия на один наносименс и проноса во втором диапазоне максимальных токов насоса.
Для каждой реализованной пары параметров соберите данные, содержащие не менее восьми пакетов, чтобы можно было сделать надежные средние измерения частоты всплесков, межсерийного интервала, длительности всплеска и периода всплеска. Затем соберите данные от нескольких дополнительных нейронов, как только что продемонстрировано, чтобы создать составной граф. Используя эту модель, ток внешнего насоса колеблется на протяжении всего цикла разрыва как внутренняя концентрация натрия вокруг базового уровня.
Этот ток насоса способствует прекращению разрыва во время фазы разрыва. Гиперполяризация, создаваемая током насоса, активирует гиперполяризацию, активируемую внутренним током во время интервала между всплесками. Модель интернейрона сердца в реальном времени показывает, что постоянный ток натрия в интернейронах сердца способствует большей части поступления натрия, сильно влияя на внутреннюю концентрацию натрия и, следовательно, на ток насоса.
Поскольку постоянный ток натрия активен при относительно отрицательных мембранных потенциалах, он противостоит току насоса как во время разрыва, так и между интервалами всплеска. Как показано на рисунке, надежное разрывное лопание восстанавливается в тонально активных интернейронах сердца путем совместного добавления постоянных токов натриевого и калиевого насоса натрия с динамическим зажимом. Предварительные результаты указывают на сильное сложное взаимодействие между двумя токами, которое может быть дополнительно изучено с использованием модели.
Успешный эксперимент зависит от хорошего обеззараживания ганглия и тщательно направленного вождения, проникновения и жужжания микроэлектрода. Мы увеличиваем динамический зажим, реализуя натрий-зависимый ток насоса, который рассчитывается путем оценки внутриклеточной концентрации иона. Такие оценки могут быть использованы для введения любого ион-зависимого тока в нейрон.
