Dinamik sıkıştırma, herhangi bir membran akımını bir nörona dönüştürebilir veya tanıtabilir. Sodyum potasyum pompasını ve kalıcı sodyum akımını bir sülük canlı bir kalp internörüsüne sokup modifiye ediyoruz. Dinamik bir lamba kullanmak, gerçek zamanlı olarak bir nörona sokulmuş herhangi bir akımın dinamiklerinin ve genliğinin tuş vuruşu ile tam kontrol sağlar.
Dinamik kelepçe gibi gerçek zamanlı etkileşimli sistemlerin geliştirilmesi tüm BMI araştırmalarının temelini desteklememektedir. Nöronların ve ağların elektriksel aktivitesi ile ilgili hücresel çalışmaların tüm yönleri dinamik kelepçe kullanımından potansiyel olarak yararlanabilir. Bu tekniğin temel zorlukları, nöronda gerçek zamanlı modelleri geliştirmek ve çalışma için seçilen nörona dinamik kramp ayarlamalarını kalibre etmektir.
Ganglion 7'nin sülük sinir kordonundan izolasyonu için, siyah bir reçine hattı diseksiyon kabını sodyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum klorür, D-glikoz ve HEPES ile desteklenmiş yaklaşık bir santimetre soğutulmuş salin ile deiyonize suya doldurun ve soğuk uyuşturulmuş sülük dorsal tarafını hazneye sabitleyin. Vücudun rostral üçüncü kısmındaki vücut duvarından en az üç santimetre uzunluğunda uzunlamasına bir kesim yapmak için eğik ışık kılavuzu aydınlatmalı 20X büyütmede stereo mikroskop ve beş milimetre yay makası kullanın. İç organları ortaya çıkarmak için vücut duvar dokusunu ayırmak ve daha iyi bir görünüm elde etmek için kanı vakumlamak için pimleri kullanın.
Tek bir orta vücut ganglion 7 izole edin. Kesmeye yardımcı olmak ve sinüsleri tutmak için keskin beş numaralı tokmakları kullanarak, sinüsü dorsally ve ventral olarak bölmeye özen göstererek sinir kordonu bulunan sinüsü açmak için makası kullanın. Ganjdan çıkan iki bilateral sinir köklerinin her birine sinüsü bağlı tutmak, ganglionu vücuttan çıkarmak için rostral ve kaudal bağ sinir demetlerini kesin ve kökleri sinüsten çıktıkları yere yanal olarak kesin.
Sinüs şeritlerini ve gevşek dokuyu kısaltılmış Minutien böcek pimleri ventral tarafı açık reçine kaplı Petri kaplarında sabitlemek için eski körelmiş beş numaralı tokmak kullanın. Rostral ve kaudal bağcıları gangliyondan mümkün olduğunca uzağa sabitleyin ve kökleri güvenli bir şekilde sabitleyin. Stereo mikroskobun büyütmesini 40X veya daha fazlasına çıkarın ve eğik aydınlatmayı, nöronal hücre gövdelerinin perineuriumun hemen altındaki ganglionun ventral tarafında kolayca gözlemlenebilecek şekilde ayarlayın.
Mikro makas kullanarak, ganglionun bir tarafındaki kökler arasındaki gevşek peroneal kılıfı kesmeye başlayın, kesmeyi yanal olarak diğer tarafa devam ettirin ve makas bıçağını doğrudan kılıfın altındaki nöronal hücre gövdelerine zarar vermeden yüzeysel tuttuğunuzdan emin olun. Orta hat boyunca yanal kesimden kaudally benzer bir yüzeysel kesim yapın ve her birinin çıkarılmasına izin vermek için bir seferde bir kaudal yanal kılıf kapağını gangliyondan uzaklaştırmak için beş numaralı ince toparlama kullanın. Her iki kapak da çıkarıldığında, her iki kalp internöronu da açığa çıkarılmalıdır.
Çanağı kayıt kurulumuna yerleştirin ve numuneyi oda sıcaklığında dakikada beş mililitre akış hızında salin ile aşırı kurun. Kayıt kurulumundaki internöronları tanımlamak için, aşağıda karanlık alan aydınlatmalı 50 ila 100X büyütme seçin ve orta gövde ganglion 7'deki posteriolateral konumdaki kanonik konumuna göre ikili çiftin bir HN 7 nöronunu bulun. Daha sonra, iki molar potasyum asetat ve 20 milimolar potasyum klorür mikro elektrot ile dolu keskin bir mikro elektrodu hedef hücre gövdesinin çok yakınına yerleştirmek için bir mikro manipülatör kullanın ve kaydedilen potansiyeli sürekli olarak gözlemlemek için nörofizyolojik bir elektrometre kullanın.
Bu potansiyeli sıfır milivolt olarak ayarlayın ve elektrotunu uzun ekseni boyunca yavaşça sürmek için manipülatörü kullanarak mikroelekrot ile nörona nüfuz edin. Membran potansiyelinde ve güçlü bir sıçrama aktivitesinde negatif bir kayma gözlenene kadar 100 milisaniyelik bir elektrometre vızıltı fonksiyonu kullanın. Elektrometreyi, akımı nörona geçirirken zar potansiyelini aynı anda kaydetmek için süreksiz akım kelepçe modunda en az üç kilohertz olarak ayarlayın.
Elektrodun ayarını izlemek için bir osiloskop kullanın ve kaydı stabilize etmek için bir ila iki dakika boyunca eksi 0,1 nanoamp sabit bir akım enjektörü kullanın. HN 7 nöronu karakteristik başak şekli ve zayıf patlama aktivitesi ile tanımlanabilir. Dinamik kelepçe iletimi ve mevcut uygulama için, dijital sinyal işleme kartı için özel olarak oluşturulmuş dinamik bir kelepçe yazılım programı açın.
Ve model çalışırken, maksimum pompa akımını 0,1 ila 0,2 nanoamps'a ayarlayın ve düzenli patlama oluşana kadar kalıcı sodyum akımının maksimum iletkenliğini kademeli olarak artırın. Pompa akımının maksimum çıkışı için bu akımları sistematik olarak 0,1 nanoamp artışlarla ve kalıcı sodyum akımının maksimum iletimi için bir nanosiemen artışında birlikte değişkenlik gösterir ve bu artışların ani frekans, patlama aralığı, patlama süresi ve patlama süresi üzerindeki etkilerini değerlendirir. Sodyum akımının maksimum iletkenliğini belirli bir sabit değerde tutun ve sodyum iletiminin sabit değerini bir nanosiemen artırmadan ve ikinci bir maksimum pompa akımı aralığını süpürmeden önce düzenli patlama aktivitesini desteklemek için bir dizi maksimum pompa akımı üzerinde bir nanoamp artışlarla süpürün.
Uygulanan her parametre çifti için, en az sekiz patlama içeren verileri toplayın, böylece ani artış frekansının, patlama ara aralığının, patlama süresinin ve patlama süresinin güvenilir ortalama ölçümleri yapılabilir. Daha sonra, kompozit bir grafik oluşturmak için gösterildiği gibi birkaç ek nörondan veri toplayın. Bu modeli kullanarak, dışa doğru pompa akımı, bir taban çizgisi seviyesi etrafında sodyumun iç konsantrasyonu olarak patlama döngüsü boyunca salınır.
Bu pompa akımı, patlama aşamasında patlama sonlandırmasına katkıda bulunur. Pompa akımı tarafından üretilen hiperpolarizasyon, patlamalar arası aralıkta içe doğru akıma aktive edilen hiperpolarizasyonu aktive eder. Gerçek zamanlı kalp internöron modeli, kalp internöronlarındaki kalıcı sodyum akımının sodyum girişinin çoğunun sodyumun iç konsantrasyonunu ve dolayısıyla pompa akımını güçlü bir şekilde etkilediğini gösterir.
Kalıcı sodyum akımı nispeten negatif membran potansiyellerinde aktif olduğundan, hem patlama hem de patlama aralıkları sırasında pompa akımına karşı çıkar. Gösterildiği gibi, tonik olarak aktif kalp internöronlarında, dinamik bir kelepçe ile kalıcı sodyum ve sodyum potasyum pompa akımlarının birlikte eklenmesiyle sağlam patlama geri yüklenir. İlk sonuçlar, iki akım arasında, model kullanılarak daha fazla araştırılabilen güçlü bir karmaşık etkileşimi göstermektedir.
Başarılı bir deney, ganglionun iyi desheathing ve dikkatlice yönlendirilmiş sürüş, nüfuz ve mikroelektonin uğultu bağlıdır. Bir iyonun hücre içi konsantrasyonunu tahmin ederek hesaplanan sodyum bağımlı pompa akımı uygulayarak dinamik kelepçeyi güçlendiriyoruz. Bu tür tahminler, iyon bağımlı herhangi bir akımı bir nörona enjekte etmek için kullanılabilir.
