동적 클램핑은 모든 멤브레인 전류를 수정하거나 뉴런으로 도입할 수 있습니다. 우리는 나트륨 칼륨 펌프와 지속적인 나트륨 전류를 거머리의 살아있는 심장 인터뉴런으로 소개하고 수정합니다. 동적 램프를 사용하면 뉴런에 도입된 모든 전류의 역학 및 진폭의 키 스트로크를 실시간으로 완벽하게 제어할 수 있습니다.
동적 클램프와 같은 실시간 대화형 시스템의 개발은 모든 BMI 연구를 뒷받침합니다. 뉴런과 네트워크의 전기 적 활동에 대한 세포 연구의 모든 측면은 동적 클램프의 사용으로부터 잠재적으로 이점을 누릴 수 있습니다. 이 기술의 주요 과제는 뉴런에서 실시간 모델을 개발하고 연구를 위해 선택한 뉴런에 동적 경련 조정을 보정하는 것입니다.
거머리 신경 코드에서 신경절 7의 격리를 위해, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, D-포도당 및 HEPES로 보충 된 차가운 식염수의 약 1 센티미터로 검은 수지 라인을 해부 접시를 채우고 차가운 마취 제이르치 dorsal 측에 고정하십시오. 비스듬한 라이트 가이드 조명과 5mm 스프링 가위를 사용하여 20X 배율에서 스테레오 현미경을 사용하여 신체의 로스트랄 세 번째 부분의 체벽을 통해 적어도 3센티미터 길이의 세로 절단을 합니다. 핀을 사용하여 신체 벽 조직을 분리하여 내부 장기를 노출시키고 혈액을 진공 청소기로 사용하여 더 나은 시야를 얻습니다.
개별 중간 몸 신경절 을 분리 7. 날카로운 숫자 다섯 집게를 사용하여 절단을 안내하고 부비동을 잡는 데 도움을 주며 가위를 사용하여 신경 코드가 있는 부비동을 열고 부비동을 주체로 분할하여 부비동을 주선하고 통풍구합니다. 신경절에서 나오는 두 개의 양자 신경 뿌리 각각에 부착 된 부비동을 유지, 몸에서 신경절을 제거하고 부비동에서 나오는 곳으로 뿌리 측면을 잘라 로스트랄과 caudal 결합 신경 번들을 잘라.
오래된 무딘 숫자 다섯 개의 집게를 사용하여 부비동 스트립과 느슨한 조직을 고정하고 투명 수지 안감 페트리 접시에 고급 미누티엔 곤충 핀 복부 면을 강화합니다. 가능한 한 간리온에서 멀리 로스트랄과 코달 결합을 고정하고 단단히 뿌리를 고정합니다. 스테레오 현미경의 배율을 40배 이상으로 늘리고 경외세포체가 회음관 바로 아래 의 복부 측에서 쉽게 관찰될 수 있도록 경사 조명을 조절한다.
마이크로 가위를 사용하여, 신경절의 한쪽에 뿌리 사이의 느슨한 연속 칼을 절단 시작, 다른 쪽으로 옆으로 절단을 계속하고 칼집 바로 아래 신경 세포 몸을 해치지 않고 가위 블레이드 피상적 유지있는지 확인. 중간선을 따라 측면 컷에서 비슷한 피상적 인 컷을 확인하고 각각 을 절제 할 수 있도록 한 번에 신경절에서 칼집의 하나의 caudal 측면 플랩을 당겨 미세 번호 다섯 집게를 사용합니다. 두 플랩이 모두 제거되면 두 심장 간 신경 세포가 모두 노출되어야합니다.
레코딩 설정에 접시를 놓고 실온에서 분당 5 밀리리터의 식염수로 샘플을 대체합니다. 기록 설정에서 인터뉴런을 식별하려면 아래 암필드 조명이 있는 50~100X 배율을 선택하고 중간 체체 신경절 7의 후방 위치에서 의 정경 위치에 의해 양측 쌍의 HN 7 뉴런을 찾아낸다. 다음으로, 마이크로 조작기를 사용하여 아세테이트 2개와 염화 칼륨 20개로 채워진 날카로운 마이크로 전극을 표적 세포 체 에 매우 가깝게 배치하고 신경 생리학적 전극을 사용하여 기록된 전위를 지속적으로 관찰한다.
이 잠재력을 0 밀리볼트로 설정하고 조작기를 사용하여 미세 전극으로 뉴런을 침투하여 긴 축을 따라 천천히 전극을 구동합니다. 100밀리초 의 전기계 버즈 기능을 사용하여 멤브레인 전위 및 격렬한 스파이크 활동의 부정적인 변화가 관찰될 때까지 사용하십시오. 전류를 뉴런으로 전달하는 동안 멤브레인 전위를 동시에 기록하기 위해 불연속 전류 클램프 모드에서 적어도 3킬로미터헤르츠로 전기계를 설정합니다.
오실로스코프를 사용하여 전극의 설정을 모니터링하고 꾸준한 전류 인젝터를 사용하여 1~2분 동안 영하 0.1 나노암프의 꾸준한 전류를 주입하여 기록을 안정화시한다. HN 7 뉴런은 특유의 스파이크 형상과 약한 파열 활성으로 식별할 수 있다. 동적 클램프 전도및 현재 구현을 위해 디지털 신호 처리 보드를 위해 사용자 정의로 빌드된 동적 클램프 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
그리고 모델이 실행되는 동안 최대 펌프 전류를 0.1 ~ 0.2 나노앰프로 설정하고 일반 파열이 계속될 때까지 영구 나트륨 전류의 최대 전도도를 점진적으로 증가시다. 이러한 전류를 0.1 나노암프 증분에 따라 펌프 전류의 최대 출력및 1나노시멘증의 최대 전도도를 위해 이러한 전류를 연속성 나트륨 전류의 최대 전도도성을 평가하고 이러한 증가의 효과를 스파이크 주파수, 버스트 간격, 버스트 지속 시간 및 버스트 기간에 대한 효과를 평가한다. 나트륨 전류의 최대 전도도를 특정 고정값으로 유지하고 1나노시멘에 의한 나트륨 전도도의 고정값을 증가시키고 두 번째 범위의 최대 펌프 전류를 휩쓸기 전에 정기적인 파열 활성을 지원하기 위해 다양한 최대 펌프 전류를 통해 하나의 나노 암프 증분으로 스윕합니다.
구현된 각 매개변수 쌍에 대해, 스파이크 주파수, 버스트 간격, 버스트 지속 시간 및 버스트 기간의 신뢰할 수 있는 평균 측정값을 만들 수 있도록 최소 8개의 버스트를 포함하는 데이터를 수집합니다. 그런 다음 복합 그래프를 생성하기 위해 입증 된 것처럼 여러 추가 뉴런에서 데이터를 수집합니다. 이 모델을 사용하여, 외부 펌프 전류는 기준수준 주위의 나트륨의 내부 농도로서 버스트 사이클 전반에 걸쳐 진동한다.
이 펌프 전류는 버스트 단계에서 버스트 종료에 기여합니다. 펌프 전류에 의해 생성된 과극화는 버스트 간격 동안 내전류가 활성화된 과극화를 활성화합니다. 실시간 심장 인터뉴런 모델은 심장 인터뉴런의 지속적인 나트륨 전류가 나트륨의 내부 농도에 강하게 영향을 미치는 나트륨 항목의 상당 부분에 기여하므로 펌프 전류가 있음을 나타냅니다.
지속적인 나트륨 전류는 상대적으로 음의 멤브레인 전위에서 활성화되기 때문에 버스트 및 버스트 간 간격 동안 펌프 전류를 반대합니다. 그림과 같이, 견고한 파열은 동적 클램프를 가진 지속적인 나트륨 및 나트륨 칼륨 펌프 전류의 공동 추가에 의해 톤 활성 심장 인터뉴런에서 복원됩니다. 예비 결과는 모델을 사용하여 더 자세히 탐색 할 수있는 두 전류 사이의 강력한 복잡한 상호 작용을 나타냅니다.
성공적인 실험은 신경절의 좋은 디싱과 신중하게 지시 된 운전, 관통 및 미세 전극의 윙윙 거리는 소리에 달려 있습니다. 당사는 이온의 세포 내 농도를 추정하여 계산되는 나트륨 의존성 펌프 전류를 구현하여 동적 클램프를 보강합니다. 이러한 추정은 뉴런에 어떤 이온 의존 전류를 주입하는 데 사용할 수 있습니다.
