Dynamisches Spannen kann jeden Membranstrom modifizieren oder in ein Neuron einführen. Wir führen die Natriumkaliumpumpe und den anhaltenden Natriumstrom in ein lebendes Herzinteruron eines Blutegels ein und modifizieren es. Die Verwendung einer dynamischen Lampe ermöglicht die vollständige Steuerung mit einem Tastendruck der Dynamik und Amplitude eines in ein Neuron in Echtzeit eingeleiteten Stroms.
Die Entwicklung interaktiver Echtzeitsysteme wie der dynamischen Klemme untermauert die gesamte BMI-Forschung. Alle Aspekte der zellulären Studien über die elektrische Aktivität von Neuronen und Netzwerken können potenziell von der Verwendung dynamischer Klemmen profitieren. Die Hauptherausforderungen dieser Technik sind die Entwicklung der Echtzeitmodelle in Neuronen und die Kalibrierung der dynamischen Krampfanpassungen an das für die Studie ausgewählte Neuron.
Zur Isolierung des Ganglions 7 aus einem Blutegelnervenstrang füllen Sie eine schwarze Harzlinie, die eine Sezierschale mit etwa einem Zentimeter gekühlter Kochsalzlösung mit Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, D-Glucose und HEPES in entionisiertem Wasser ergänzt, und stecken Sie eine kalte betäubte Blutegel dorsale Seite nach oben in die Kammer. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einer 20-fachen Vergrößerung mit schräger Lichtleiterbeleuchtung und einer Fünf-Millimeter-Federschere, um einen mindestens drei Zentimeter langen Längsschnitt durch die Körperwand im rostralen dritten Teil des Körpers zu machen. Verwenden Sie Stifte, um das Körperwandgewebe auseinanderzuziehen, um die inneren Organe freizulegen, und saugen Sie das Blut ab, um eine bessere Sicht zu erhalten.
Isolieren Sie ein einzelnes Ganglion 7 im Mittelkörper. Verwenden Sie eine scharfe Nummer fünf, um den Schnitt zu führen und den Sinus zu halten, verwenden Sie die Schere, um den Sinus zu öffnen, in dem sich das Nervenstrang befindet, und achten Sie darauf, den Sinus dorsal und ventral zu spalten. Halten Sie den Sinus an jeder der beiden bilateralen Nervenwurzeln befestigt, die aus dem Ganglion hervorgehen, schneiden Sie die rostralen und kaudalen Bindenervenbündel, um das Ganglion aus dem Körper zu entfernen, und schneiden Sie die Wurzeln seitlich zu der Stelle, an der sie aus dem Sinus hervorgehen.
Verwenden Sie eine alte abgestumpfte Pinzette Nummer fünf, um die Sinusstreifen und das lose Gewebe mit verkürzten Minutien-Insektenstiften ventraler Seite nach oben in klaren, mit Harz ausgekleideten Petrischalen zu sichern. Stecken Sie die rostralen und kaudalen Verbindungen so weit wie möglich vom Ganglion entfernt und die Wurzeln sicher fest. Erhöhen Sie die Vergrößerung des Stereomikroskops auf das 40-fache oder mehr und stellen Sie die schräge Beleuchtung so ein, dass die neuronalen Zellkörper auf der ventralen Seite des Ganglions direkt unterhalb des Perineuriums leicht beobachtet werden können.
Beginnen Sie mit einer Mikroschere, schneiden Sie die lose Peronealscheide zwischen den Wurzeln auf einer Seite des Ganglions, setzen Sie den Schnitt seitlich auf die andere Seite fort und stellen Sie sicher, dass die Scherenklinge oberflächlich bleibt, ohne die neuronalen Zellkörper direkt unter der Scheide zu schädigen. Machen Sie einen ähnlichen oberflächlichen Schnitt kaudal vom seitlichen Schnitt entlang der Mittellinie und verwenden Sie eine feine Nummer fünf-Zette, um jeweils eine kaudale seitliche Hüllenklappe vom Ganglion wegzuziehen, damit jeder herausgeschnitten werden kann. Wenn beide Klappen entfernt wurden, sollten beide Herzinternuronen freigelegt werden.
Stellen Sie die Schüssel in das Aufnahmesetup und übertünchten Sie die Probe mit Kochsalzlösung bei einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute bei Raumtemperatur. Um die Interneuronen auf dem Aufnahmeaufbau zu identifizieren, wählen Sie eine 50- bis 100-fache Vergrößerung mit Dunkelfeldbeleuchtung unten und lokalisieren Sie ein HN 7-Neuron des bilateralen Paares anhand seiner kanonischen Position an der posteriolateralen Position im Mittelkörperganglion 7. Als nächstes verwenden Sie einen Mikromanipulator, um eine scharfe Mikroelektrode, die mit zwei molaren Kaliumacetat und 20 Millimolaren Kaliumchlorid-Mikroelektroden gefüllt ist, ganz in der Nähe des Zielzellkörpers zu positionieren, und verwenden Sie ein neurophysiologisches Elektrometer, um das aufgezeichnete Potential kontinuierlich zu beobachten.
Stellen Sie dieses Potential auf null Millivolt ein und dringen Sie mit der Mikroelektrode mit dem Manipulator in das Neuron ein, um die Elektrode langsam entlang ihrer langen Achse zu treiben. Verwenden Sie eine 100-Millisekunden-Elektrometer-Brummfunktion, bis eine negative Verschiebung des Membranpotentials und eine starke Spiking-Aktivität beobachtet werden. Stellen Sie das Elektrometer im diskontinuierlichen Stromklemmenmodus auf mindestens drei Kilohertz ein, um gleichzeitig das Membranpotential aufzuzeichnen und gleichzeitig den Strom an das Neuron weiterzugeben.
Verwenden Sie ein Oszilloskop, um die Einstellung der Elektrode zu überwachen, und verwenden Sie einen Konstantstrominjektor, um einen konstanten Strom von minus 0,1 Nanoampere für ein bis zwei Minuten zu injizieren, um die Aufnahme zu stabilisieren. Das HN 7-Neuron kann durch seine charakteristische Spikeform und schwache Berstaktivität identifiziert werden. Für die dynamische Klemmleitfähigkeit und aktuelle Implementierung öffnen Sie ein dynamisches Klemmsoftwareprogramm, das speziell für die digitale Signalverarbeitungsplatine entwickelt wurde.
Und während das Modell läuft, stellen Sie den maximalen Pumpenstrom auf 0,1 bis 0,2 Nanoampere ein und erhöhen Sie allmählich den maximalen Leitfähigkeit des persistenten Natriumstroms, bis ein regelmäßiges Platzen folgt. Variieren Sie diese Ströme systematisch in 0,1-Nanoampere-Schritten für die maximale Leistung des Pumpenstroms und einem Nanosiemens-Schritt für die maximale Leitfähigkeit des persistenten Natriumstroms und bewerten Sie die Auswirkungen dieser Erhöhungen auf die Spike-Frequenz, das Inter-Burst-Intervall, die Burst-Dauer und die Burst-Periode. Halten Sie den maximalen Leitwert des Natriumstroms an einem bestimmten festen Wert und streichen Sie in einem Nanoampereschritt über einen Bereich maximaler Pumpenströme, um die regelmäßige Berstaktivität zu unterstützen, bevor Sie den festen Wert der Natriumleitfähigkeit um ein Nanosiemens erhöhen und über einen zweiten Bereich maximaler Pumpenströme fegen.
Sammeln Sie für jedes implementierte Parameterpaar Daten mit mindestens acht Bursts, damit zuverlässige durchschnittliche Messungen der Spike-Frequenz, des Inter-Burst-Intervalls, der Burst-Dauer und der Burst-Periode durchgeführt werden können. Sammeln Sie dann Daten von mehreren zusätzlichen Neuronen, wie gerade gezeigt, um einen zusammengesetzten Graphen zu generieren. Bei Diesem Modell oszilliert der nach außen gerichtete Pumpenstrom während des gesamten Burst-Zyklus als interne Natriumkonzentration um ein Ausgangsniveau.
Dieser Pumpenstrom trägt zum Burst-Abschluss während der Burst-Phase bei. Die durch den Pumpenstrom erzeugte Hyperpolarisation aktiviert den hyperpolarisierend inwarden Strom während des Inter-Burst-Intervalls. Das Echtzeit-Herz-Interneuron-Modell zeigt, dass der persistente Natriumstrom in Herzinterneuren dazu beiträgt, dass ein Großteil des Natriumeintrags die interne Konzentration des Natriums und damit den Pumpenstrom stark beeinflusst.
Da der persistente Natriumstrom bei relativ negativen Membranpotentialen aktiv ist, steht er dem Pumpenstrom sowohl während des Burst- als auch des Inter-Burst-Intervalls entgegen. Wie dargestellt, wird das robuste Bersten in tonisch aktiven Herzinterneurinen durch die gleichzeitige Zugabe von persistenten Natrium- und Natriumkaliumpumpenströmen mit einer dynamischen Klemme wiederhergestellt. Vorläufige Ergebnisse deuten auf eine starke komplizierte Wechselwirkung zwischen den beiden Strömungen hin, die mit dem Modell weiter untersucht werden kann.
Ein erfolgreiches Experiment hängt von der guten Entmantelung des Ganglions und dem sorgfältig gesteuerten Fahren, Eindringen und Summen der Mikroelektrode ab. Wir erweitern die dynamische Klemme, indem wir einen natriumabhängigen Pumpenstrom implementieren, der durch Abschätzung der intrazellulären Konzentration eines Ions berechnet wird. Solche Schätzungen können verwendet werden, um jeden ionenabhängigen Strom in ein Neuron zu injizieren.
