動的クランプは、任意の膜電流を変更またはニューロンに導入することができます。ナトリウムカリウムポンプと持続ナトリウム電流を、リーチの生きた心臓インターニューロンに導入・変更します。ダイナミックランプを使用すると、リアルタイムでニューロンに導入された任意の電流のダイナミクスと振幅のキーストロークで完全な制御が可能になります。
ダイナミッククランプなどのリアルタイムインタラクティブシステムの開発は、すべてのBMI研究を支えています。ニューロンとネットワークの電気的活動に関する細胞研究のすべての側面は、潜在的に動的クランプの使用から利益を得ることができます。この技術の主な課題は、ニューロンのリアルタイムモデルを開発し、研究のために選択されたニューロンに動的けいれん調整を較正することです。
神経節7をリーチ神経コードから分離するために、黒い樹脂ラインを塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、Dグルコース、HEPESを補った冷たい生理食塩水の約1センチメートルを脱イオン水に充填し、冷たい麻酔付きリーチドーサル側をチャンバーにピンで留めます。斜めのライトガイド照明と5ミリメートルのスプリングハサミで20倍の倍率でステレオ顕微鏡を使用して、身体の下部第3部分の体壁を通して長手方向の切断を少なくとも3センチメートルにします。ピンを使用して体壁組織を引き離して内臓を露出させ、血液を掃除機をかけ、より良い視界を得る。
個々の中型神経節7を分離する。鋭い数5鉗子を使用して切断を導き、正気を保持し、はさみを使用して神経コードが存在する正気を開き、側線と腹側を裂くように注意してください。神経節から出てくる2つの両側神経根のそれぞれに根本の根を取り付け、鼻と尾子の結合神経束を切って神経節を体から取り除き、根を横に切って、根を鼻から出てくる場所に切り取る。
古い鈍いナンバー5鉗子を使用して、透明な樹脂が並ぶペトリ皿で短くなったミヌティエン昆虫ピン腹側で副根ストリップと緩い組織を固定します。可能な限りギャングリオンから離れてrostralと尾子の結合をピンし、しっかりと根をピン留めします。立体顕微鏡の倍率を40倍以上に増やし、神経細胞体が腹膜のすぐ下の神経節側で容易に観察できるように斜めの照明を調整します。
マイクロハサミを使用して、神経節の片側の根の間の緩い骨膜鞘を切断し始め、反対側に横方向に切断を続け、鞘の真下の神経細胞体に害を与えることなく、はさみ刃を表面的に保つようにします。正中線に沿って横切りから同様の表面的なカットを行い、細かい番号5鉗子を使用して、シースの1つの尾側面フラップを一度にガングリオンから引き離して切除できるようにします。両方のフラップが取り除かれたら、両方の心臓インターニューロンが露出するべきである。
録音セットアップに皿を置き、室温で毎分5ミリリットルの流量で生理食塩水でサンプルを過大化します。記録設定でニューロン間を識別するには、暗視野照明を下に50〜100X倍率を選択し、中体神経節7の後方位置に正準位置で両側対のHN 7ニューロンを見つける。次に、マイクロマニピュレータを使用して、標的細胞本体の非常に近くに2つの酢酸カリウムカリウムと20ミリモルクロリドマイクロ電極を充填した鋭利なマイクロ電極を配置し、神経生理学的電計を使用して記録された電位を連続的に観察します。
この電位をゼロミリボルトに設定し、マニピュレータを使用してマイクロ電極でニューロンを貫通し、長い軸に沿ってゆっくりと電極を駆動します。膜電位の負のシフトと活発なスパイク活性が観察されるまで、100ミリ秒の電光計バズ機能を使用してください。不連続電流クランプモードで少なくとも3キロヘルツに電気計を設定し、同時にニューロンに電流を流しながら膜電位を記録します。
オシロスコープを使用して電極の設定を監視し、安定した電流インジェクターを使用して、1〜2分間マイナス0.1ナノアンプの安定した電流を注入して記録を安定させます。HN 7ニューロンは、その特徴的なスパイク形状と弱い破裂活性によって同定することができる。動的クランプのコンダクタンスと現在の実装のために、デジタル信号処理ボード用にカスタム構築されたダイナミッククランプソフトウェアプログラムを開きます。
また、モデルの実行中に、最大ポンプ電流を0.1~0.2ナノアンペアに設定し、通常の破裂が続くまで持続性ナトリウム電流の最大コンダクタンスを徐々に増加させます。ポンプ電流の最大出力と、持続性ナトリウム電流の最大導通度に対する1つのナノシーメン増分について、0.1ナノアンペア単位でこれらの電流を体系的に共変し、スパイク周波数、インターバースト間隔、バースト期間、バースト期間に対するこれらの増加の影響を評価します。特定の固定値でナトリウム電流の最大伝導を保持し、1つのナノシーメンによるナトリウム伝導の固定値を増加させ、最大ポンプ電流の第2範囲を掃引する前に、通常の破裂活性をサポートするために、最大ポンプ電流の範囲にわたって1ナノアンペア増分で掃引します。
実装されたパラメータペアごとに、スパイク周波数、インターバースト間隔、バースト期間、バースト期間の信頼性の高い平均測定値を作成できるように、少なくとも8つのバーストを含むデータを収集します。次に、複合グラフを生成するために示したように、いくつかの追加のニューロンからデータを収集します。このモデルを使用すると、外側のポンプ電流は、ベースラインレベルの周りのナトリウムの内部濃度としてバーストサイクル全体を通して振動します。
このポンプ電流は、バーストフェーズ中のバースト終端に寄与します。ポンプ電流によって生成される超分極は、インターバースト間隔の間に内流に活性化された超分極を活性化する。リアルタイム心臓インターニューロンモデルは、心のインターニューロンにおける持続性ナトリウム電流がナトリウムの内部濃度に強く影響を与えるナトリウムエントリーの多く、したがってポンプ電流に寄与することを示す。
持続性ナトリウム電流は比較的陰性の膜電位で活性であるため、バースト間隔とインターバースト間隔の両方でポンプ電流に対して反応します。図示したように、堅牢な破裂は、動的クランプを備えた永続的なナトリウムとナトリウムカリウムポンプ電流の共加によって、トーン的に活性な心臓インターニューロンに回復する。予備的な結果は、モデルを使用してさらに検討することができる2つの電流間の強い複雑な相互作用を示しています。
実験が成功した場合、ガングリオンの良好な脱シーシングと慎重に指示されたマイクロ電極の駆動、浸透、およびブンブンに依存します。イオンの細胞内濃度を推定して計算されるナトリウム依存ポンプ電流を実装することで、動的クランプを増強します。このような推定値は、ニューロンに任意のイオン依存電流を注入するために使用することができます。
