Le serrage dynamique peut modifier ou introduire n’importe quel courant membranaire dans un neurone. Nous introduisons et modifions la pompe sodium-potassium et le courant de sodium persistant dans un interneuron cardiaque vivant d’une sangsue. L’utilisation d’une lampe dynamique permet un contrôle complet avec une frappe de la dynamique et de l’amplitude de tout courant introduit dans un neurone en temps réel.
Le développement de systèmes interactifs en temps réel tels que la pince dynamique sous-tend toutes les recherches sur l’IMC. Tous les aspects des études cellulaires sur l’activité électrique des neurones et des réseaux peuvent potentiellement bénéficier de l’utilisation de la pince dynamique. Les principaux défis de cette technique sont le développement de modèles en temps réel dans les neurones et l’étalonnage des ajustements dynamiques des crampes au neurone sélectionné pour l’étude.
Pour isoler le ganglion 7 d’un cordon nerveux de sangsue, remplissez une ligne de résine noire disséquant le plat avec environ un centimètre de solution saline réfrigérée complétée par du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du chlorure de calcium, du D-glucose et du HEPES dans de l’eau désionisée et épinglez une sangsue anesthésiée froide côté dorsal dans la chambre. Utilisez un stéréomicroscope à un grossissement de 20X avec un éclairage de guide de lumière oblique et des ciseaux à ressort de cinq millimètres pour faire une coupe longitudinale d’au moins trois centimètres de long à travers la paroi du corps dans la troisième partie rostrale du corps. Utilisez des épingles pour séparer le tissu de la paroi du corps afin d’exposer les organes internes et aspirez le sang pour obtenir une meilleure vue.
Isoler un ganglion individuel du milieu du corps 7. En utilisant des pinces pointues numéro cinq pour aider à guider la coupe et pour maintenir le sinus, utilisez les ciseaux pour ouvrir le sinus dans lequel réside le cordon nerveux, en prenant soin de diviser le sinus dorsalement et ventralement. En gardant le sinus attaché à chacune des deux racines nerveuses bilatérales qui émergent du ganglion, coupez les faisceaux de nerfs conjonctifs rostral et caudal pour enlever le ganglion du corps et coupez les racines latérales à l’endroit où elles émergent du sinus.
Utilisez de vieilles pinces numéro cinq émoussées pour fixer les bandes sinusales et les tissus lâches avec des épingles à insectes Minutien raccourcies côté ventral vers le haut dans des boîtes de Petri doublées de résine transparente. Épinglez les conjonctifs rostral et caudal aussi loin que possible du ganglion et épinglez solidement les racines. Augmentez le grossissement du stéréomicroscope à 40X ou plus et ajustez l’éclairage oblique de sorte que les corps cellulaires neuronaux puissent être facilement observés sur le côté ventral du ganglion juste en dessous du périneurium.
À l’aide de micro-ciseaux, commencez à couper la gaine péronère lâche entre les racines d’un côté du ganglion, en continuant la coupe latéralement de l’autre côté et en vous assurant de garder la lame de ciseaux superficielle sans endommager les corps cellulaires neuronaux directement sous la gaine. Faites une coupe superficielle similaire caudalement à partir de la coupe latérale le long de la ligne médiane et utilisez une pince fine numéro cinq pour tirer un lambeau latéral caudal de gaine loin du ganglion à la fois pour permettre à chacun d’être excisé. Lorsque les deux lambeaux ont été retirés, les deux interneurones cardiaques doivent être exposés.
Placez la parabole dans la configuration d’enregistrement et superamorcez l’échantillon avec une solution saline à un débit de cinq millilitres par minute à température ambiante. Pour identifier les interneurones sur la configuration d’enregistrement, sélectionnez un grossissement de 50 à 100X avec un éclairage de champ sombre ci-dessous et localisez un neurone HN 7 de la paire bilatérale par son emplacement canonique à la position postriolatérale dans le ganglion 7 du milieu du corps. Ensuite, utilisez un micro manipulateur pour positionner une micro-électrode pointue remplie de deux acétate de potassium molaire et d’une micro électrode de chlorure de potassium de 20 millimolaires très près du corps de la cellule cible et utilisez un électromètre neurophysiologique pour observer en permanence le potentiel enregistré.
Réglez ce potentiel à zéro millivolts et pénétrez dans le neurone avec la microélectronique à l’aide du manipulateur pour entraîner lentement l’électrode le long de son long axe. Utilisez une fonction de bourdonnement de l’électromètre de 100 millisecondes jusqu’à ce qu’un changement négatif du potentiel membranaire et une activité de pic vigoureuse sont observés. Réglez l’électromètre sur au moins trois kilohertz en mode de serrage de courant discontinu pour enregistrer simultanément le potentiel de la membrane tout en transmettant le courant au neurone.
Utilisez un oscilloscope pour surveiller le réglage de l’électrode et utilisez un injecteur de courant constant pour injecter un courant constant de moins 0,1 nanoampère pendant une à deux minutes pour stabiliser l’enregistrement. Le neurone HN 7 peut être identifié par sa forme de pointe caractéristique et sa faible activité d’éclatement. Pour la conductance de serrage dynamique et la mise en œuvre actuelle, ouvrez un logiciel de serrage dynamique conçu sur mesure pour la carte de traitement du signal numérique.
Et pendant que le modèle fonctionne, réglez le courant maximal de la pompe à 0,1 à 0,2 nanoampères et augmentez progressivement la conductance maximale du courant de sodium persistant jusqu’à ce qu’un éclatement régulier s’ensuive. Faire systématiquement varier ces courants par incréments de 0,1 nanoampère pour la sortie maximale du courant de la pompe et d’un nanosiemens incréments pour la conductance maximale du courant de sodium persistant et évaluer les effets de ces augmentations sur la fréquence de pointe, l’intervalle inter-rafale, la durée de rafale et la période de rafale. Maintenez la conductance maximale du courant de sodium à une valeur fixe spécifique et balayez par incréments d’un nanoampère sur une plage de courants de pompe maximaux pour soutenir une activité d’éclatement régulière avant d’augmenter la valeur fixe de la conductance de sodium d’un nanosiemens et de balayer une deuxième plage de courants de pompe maximaux.
Pour chaque paire de paramètres implémentée, collectez des données contenant au moins huit rafales afin de pouvoir effectuer des mesures moyennes fiables de la fréquence de pointe, de l’intervalle entre rafales, de la durée des rafales et de la période de rafale. Ensuite, collectez des données à partir de plusieurs neurones supplémentaires comme cela vient d’être démontré pour générer un graphique composite. En utilisant ce modèle, le courant de la pompe vers l’extérieur oscille tout au long du cycle d’éclatement en tant que concentration interne de sodium autour d’un niveau de base.
Ce courant de pompe contribue à la terminaison de l’éclatement pendant la phase d’éclatement. L’hyperpolarisation produite par le courant de la pompe active l’hyperpolarisation activée vers l’intérieur pendant l’intervalle inter-rafale. Le modèle d’interneuroone cardiaque en temps réel indique que le courant de sodium persistant dans les interneurones cardiaques contribue à ce qu’une grande partie de l’entrée de sodium affecte fortement la concentration interne du sodium et donc le courant de la pompe.
Parce que le courant de sodium persistant est actif à des potentiels membranaires relativement négatifs, il s’oppose au courant de la pompe pendant les intervalles d’éclatement et d’inter-éclatement. Comme illustré, l’éclatement robuste est restauré dans les interneurones cardiaques tonalement actifs par la co-addition de courants persistants de pompe sodium et sodium potassium avec une pince dynamique. Les résultats préliminaires indiquent une forte interaction compliquée entre les deux courants, qui peut être explorée plus avant à l’aide du modèle.
Une expérience réussie dépend du bon desthéchauffage du ganglion et de la conduite, de la pénétration et du bourdonnement soigneusement dirigés de la microélectronique. Nous augmentons la pince dynamique en mettant en œuvre un courant de pompe dépendant du sodium qui est calculé en estimant la concentration intracellulaire d’un ion. De telles estimations peuvent être utilisées pour injecter n’importe quel courant dépendant des ions dans un neurone.
