El pinzamiento dinámico puede modificar o introducir cualquier corriente de membrana en una neurona. Introducimos y modificamos la bomba de sodio y potasio y la corriente de sodio persistente en una interneurona cardíaca viva de una sanguijuela. El uso de una lámpara dinámica permite un control completo con una pulsación de tecla de la dinámica y amplitud de cualquier corriente introducida en una neurona en tiempo real.
El desarrollo de sistemas interactivos en tiempo real, como la abrazadera dinámica, sustenta toda la investigación del IMC. Todos los aspectos de los estudios celulares sobre la actividad eléctrica de las neuronas y las redes pueden beneficiarse potencialmente del uso de la pinza dinámica. Los principales retos de esta técnica son el desarrollo de los modelos en tiempo real en neurona y la calibración de los ajustes dinámicos de calambres a la neurona seleccionada para su estudio.
Para el aislamiento del ganglio 7 de un cordón nervioso de sanguijuela, llene un plato de disección de línea de resina negra con aproximadamente un centímetro de solución salina refrigerada suplementada con cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, D-glucosa y HEPES en agua desionizada y fije un lado dorsal de sanguijuela anestesiado frío hacia arriba en la cámara. Use un microscopio estéreo con un aumento de 20X con iluminación de guía de luz oblicua y tijeras de resorte de cinco milímetros para hacer un corte longitudinal de al menos tres centímetros de largo a través de la pared del cuerpo en la tercera parte rostral del cuerpo. Use alfileres para separar el tejido de la pared del cuerpo para exponer los órganos internos y aspire la sangre para obtener una mejor vista.
Aislar un ganglio individual de la mitad del cuerpo 7. Usando fórceps afilados número cinco para ayudar a guiar el corte y para sostener el seno, use las tijeras para abrir el seno en el que reside el cordón nervioso, teniendo cuidado de dividir el seno dorsal y ventralmente. Manteniendo el seno unido a cada una de las dos raíces nerviosas bilaterales que emergen del ganglio, corte los haces de nervios conectivos rostral y caudal para eliminar el ganglio del cuerpo y corte las raíces laterales a donde emergen del seno.
Use fórceps viejos embotados número cinco para asegurar las tiras sinusales y el tejido suelto con alfileres de insecto Minutien acortados del lado ventral hacia arriba en placas de Petri forradas de resina transparente. Fije los conectivos rostrales y caudales lo más lejos posible del ganglio y fije las raíces de forma segura. Aumente la ampliación del microscopio estereoscópico a 40X o más y ajuste la iluminación oblicua de modo que los cuerpos celulares neuronales se puedan observar fácilmente en el lado ventral del ganglio justo debajo del perineurio.
Usando micro tijeras, comience a cortar la funda peroneo suelta entre las raíces en un lado del ganglio, continuando el corte lateralmente hacia el otro lado y asegurándose de mantener la hoja de tijera superficial sin dañar los cuerpos celulares neuronales directamente debajo de la funda. Haga un corte superficial similar caudalmente desde el corte lateral a lo largo de la línea media y use fórceps finos número cinco para alejar un colgajo lateral caudal de la vaina del ganglio a la vez para permitir que cada uno sea extirpado. Cuando se han extraído ambos colgajos, ambas interneuronas cardíacas deben exponerse.
Coloque el plato en la configuración de grabación y superfuse la muestra con solución salina a un caudal de cinco mililitros por minuto a temperatura ambiente. Para identificar las interneuronas en la configuración de grabación, seleccione un aumento de 50 a 100X con iluminación de campo oscuro debajo y ubique una neurona HN 7 del par bilateral por su ubicación canónica en la posición posteriolateral en el ganglio de cuerpo medio 7. A continuación, use un micro manipulador para colocar un microelectrodo afilado lleno de acetato de potasio molar y microelectrodo de cloruro de potasio milimolar de 20 muy cerca del cuerpo celular objetivo y use un electrómetro neurofisiológico para observar continuamente el potencial registrado.
Ajuste este potencial a cero milivoltios y penetre en la neurona con el microelectrodo utilizando el manipulador para conducir lentamente el electrodo a lo largo de su eje largo. Utilice una función de zumbido de electrometro de 100 milisegundos hasta que se observe un cambio negativo en el potencial de membrana y una actividad de aumento vigorosa. Ajuste el electrómetro a al menos tres kilohercios en modo de abrazadera de corriente discontinua para registrar simultáneamente el potencial de membrana mientras pasa la corriente a la neurona.
Use un osciloscopio para monitorear el ajuste del electrodo y use un inyector de corriente constante para inyectar una corriente constante de menos 0.1 nanoampes durante uno o dos minutos para estabilizar la grabación. La neurona HN 7 se puede identificar por su característica forma de espiga y su débil actividad de estallido. Para la conductancia dinámica de la abrazadera y la implementación actual, abra un programa de software de abrazadera dinámica personalizado para la placa de procesamiento de señal digital.
Y mientras el modelo está funcionando, establezca la corriente máxima de la bomba en 0.1 a 0.2 nanoamps y aumente gradualmente la conductancia máxima de la corriente de sodio persistente hasta que se produzca un estallido regular. Co-variar sistemáticamente estas corrientes en incrementos de 0,1 nanoamp para la salida máxima de la corriente de la bomba e incrementos de un nanosiemens para la máxima conductancia de la corriente de sodio persistente y evaluar los efectos de estos aumentos en la frecuencia de pico, el intervalo entre ráfagas, la duración de la ráfaga y el período de ráfaga. Mantenga la conductancia máxima de la corriente de sodio en un valor fijo específico y barre en incrementos de un nanoamp sobre un rango de corrientes máximas de la bomba para apoyar la actividad de estallido regular antes de aumentar el valor fijo de la conductancia de sodio en un nanosiemens y barrer sobre un segundo rango de corrientes de bomba máximas.
Para cada par de parámetros implementado, recopile datos que contengan al menos ocho ráfagas para que se puedan realizar mediciones promedio confiables de la frecuencia de pico, el intervalo entre ráfagas, la duración de la ráfaga y el período de ráfaga. Luego recopile datos de varias neuronas adicionales como se acaba de demostrar para generar un gráfico compuesto. Usando este modelo, la corriente de la bomba hacia afuera oscila a lo largo del ciclo de ruptura como la concentración interna de sodio alrededor de un nivel basal.
Esta corriente de la bomba contribuye a la terminación de la ráfaga durante la fase de ruptura. La hiperpolarización producida por la corriente de la bomba activa la hiperpolarización activada por la corriente interna durante el intervalo entre ráfagas. El modelo de interneuronas cardíacas en tiempo real indica que la corriente de sodio persistente en las interneuronas cardíacas contribuye a gran parte de la entrada de sodio que afecta fuertemente la concentración interna del sodio y, por lo tanto, la corriente de la bomba.
Debido a que la corriente de sodio persistente está activa a potenciales de membrana relativamente negativos, se opone a la corriente de la bomba durante los intervalos de ráfaga e interventa. Como se ilustra, el estallido robusto se restaura en las interneuronas cardíacas tonicamente activas mediante la coadición de corrientes persistentes de bomba de sodio y potasio de sodio con una abrazadera dinámica. Los resultados preliminares indican una fuerte interacción complicada entre las dos corrientes, que se puede explorar más a fondo utilizando el modelo.
Un experimento exitoso depende de la buena desvainación del ganglio y de la conducción, penetración y zumbido cuidadosamente dirigidos del microelectrodo. Aumentamos la abrazadera dinámica mediante la implementación de una corriente de bomba dependiente de sodio que se calcula estimando la concentración intracelular de un ion. Tales estimaciones se pueden utilizar para inyectar cualquier corriente dependiente de iones en una neurona.
