Старение характеризуется зависящим от времени ухудшением нескольких клеточных процессов, что в конечном итоге повышает вероятность смерти организма. В популяции этот процесс является переменным, и на него может повлиять ряд генетических и экологических факторов. Одной из наиболее изученных и понятных переменных является роль диеты на протяжении всей жизни.
Диетическое ограничение является вмешательством, которое в конечном итоге задерживает наступление старения и связанных со старением изменений. Это увеличивает продолжительность жизни и продолжительность жизни организма, или продолжительность времени, когда организм имеет нормальную, здоровую жизнь. Наше нынешнее понимание привело к выявлению отдельного набора клеточных изменений, которые были называются признаками старения, таких как накопление мутаций, дисрегуляция теломер, потеря белка гомеостаза, проблемы с дыханием, и реактивных видов кислорода, среди других.
Теперь большая часть этого понимания происходит от исследований, которые используют много различных организмов модели. Там было много генетических экранов, которые определили гены, которые как сократить и продлить срок службы. К ним относятся исследования в начинающих дрожжах Saccharomyces cerevisiae, который находится в центре внимания этой методологии, а также исследования в более сложных многоклеточных организмах, таких как C.elegans и murine system.
Из них, хотя, подающий надежды дрожжей особенно подменяется для старения исследований из-за его короткой естественной продолжительности жизни и ряд генетических подходов, которые могут разгадать сложные генетические отношения, что делает его отличной системой для функционального вскрытия генетики старения. Дрожжи могут быть использованы для изучения нескольких различных аспектов старения. И мы сосредоточимся на хронологической продолжительности жизни, которая является продолжительностью, что клетка может выжить.
Цель этой работы состоит в том, чтобы представить простой генетический подход для выполнения чрезмерного выражения супрессора экрана. Мы будем использовать генетический фон, который приводит к аномально сокращенной хронологической продолжительности жизни. И мы будем использовать целенаправленный подход для выявления генов, которые могут спасти или подавить фенотип сокращенной продолжительности жизни, пытаясь определить гены, которые восстанавливают нормальную жизнь.
Первым генетическим фоном является аутофагия-дефицит дрожжей. Аутофагия, которая свободно переводится как самопоедание, является внутриклеточной системой деградации для доставки цитосольных продуктов, таких как белки и органеллы, в лизосому. Это помогает поддерживать клеточный гомеостаз, устраняя поврежденные белки, а также те, которые пережили свою жизнь.
Мы будем работать с мутантным штаммом, который имеет удаление гена ATG1. ATG1 коды для белка серина / трионина-белка киназы, которая необходима для формирования пузырьков и аутофагии в цитоплазмы до вакуола ориентации пути. Нулевой мутант ATG1 имеет фенотип аномально короткой хронологической продолжительности жизни.
В этой лаборатории старения, мы будем проектировать и тестировать генетические факторы, которые могут спасти, или подавить, аномально сокращенной продолжительности жизни характерные для ATG1 нулевой мутант. Тем не менее, это может быть расширено на другие недолговечные генетические фоны, а также. Первым шагом в этом процессе является выявление гена, который связан с продлением срока службы.
Мы сосредоточимся конкретно на генах, которые продлевают хронологическую продолжительность жизни, когда они чрезмерно выражены. Для этого мы собираемся использовать общедоступные данные, доступные из базы данных генома дрожжей. Мы подохвьем сюда.
Поиск по фенотипу. И примерно на полпути вниз, мы увидим, что мы можем выбрать хронологический срок службы. Чтобы искать гены, которые увеличивают продолжительность жизни, вы можете видеть богатство данных, доступных, что имеет гены, связанные с этим конкретным фенотипом.
Сегодня мы будем изучать SIR2, диацетилазу литона, которая связана с продленной хронологической продолжительностью жизни, когда она чрезмерно выражена. Первое, что мы сделаем, это получить доступ к последовательности ДНК для области кодирования, а также нормативных регионов, которые фланг обе стороны этого гена. Мы возьмем 400 базовых пар вверх и вниз по течению, чтобы быть уверенными, что мы охватим все регионы регулирования.
Мы будем использовать эту последовательность ДНК для разработки праймеров ПЦР, которые позволят нам клонировать этот ген в наш плазмидный вектор. Мы будем использовать ПЦР, чтобы усилить наш ген и клонировать его в вектор pRS315. Для этого мы спроектируем праймеры, которые содержат сайты пищеварения ограничений, которые включают сайты ограничения HindIII и SacII.
Как вы можете видеть, плазмида содержит как сайты ограничения, HindIII и SacII, что облегчит наше клонирование. Вы должны разработать ПЦР грунтовки, чтобы содержать около 21 или 22 нуклеотидов последовательности бесплатно в регионе, который вы хотите усилить. В дополнение к последовательности, вы добавите на пяти основных концах из них соответствующий сайт ограничения, либо HindIII на вперед грунтовки, или SacII на обратном грунтовке, показанный здесь в красном и фиолетовом соответственно, и далее вверх по течению, что добавить несколько нуклеотидов, которые позволят фермента ограничения связывать и создавать место пищеварения ограничения с более высокой эффективностью.
Вырастить пять миллилитров культуры диких дрожжей типа ночь после журнала фазы обогащенных средств массовой информации, таких как YPAD. Урожай геномной ДНК с использованием коммерчески доступного комплекта, который специфичен для грибковой геномной изоляции. Важно, что комплект специфичен для дрожжей, так как они имеют очень жесткую и жесткую стену клетки, чтобы проникнуть.
Лечение зимолязы эффективно при переваривании клеточной стенки и значительно повышает геномную урожайность. Используйте спектрофотометр для определения количества и качества ДНК. Для создания ампликона, пригодного для клонирования, необходимо использовать полимеразу СПК высокой точности, чтобы избежать мутаций в процессе усиления.
Есть много различных высокой точности ПЦР комплекты, которые являются коммерчески доступными. Чтобы облегчить оптимизацию реакции, мы рекомендуем выбрать комплект, который обеспечивает несколько буферных систем, один, который является стандартным буфером высокой точности, и один оптимизирован для высокого содержания GC в сложных amplicons. Мы добавим 200 нанограммов нашей геномной ДНК.
Мы добавим пять микролитров нашего буфера. Мы собираемся добавить 2 1 / 2 микролитров нашего вперед и наши обратные грунтовки. Мы добавим один микролитер нашей полимеразы, два микролитров D NTPs.
И, наконец, мы собираемся, чтобы КС всю реакцию на 50 микролитров со стерильной дистиллированной водой. Мы забудем реакцию в соответствии с протоколом, специфичный для фермента, который мы используем, а также для грунтовок, которые мы разработали в этом эксперименте. Очистка и сконцентрировать реакцию ПЦР.
Выращиваем пятими миллилитровую культуру E.coli в одночасье в селективных средствах массовой информации. Пеллет культуры центрифугации и отказаться от супернатанта. Resuspend и подлить клетки в при условии, chaotropic буфера в течение пяти минут.
Нейтрализуйте реакцию и смешайте два инверсии пять или шесть раз. Центрифуга вашего образца в течение 10 минут на максимальной скорости. Перенесите супернатант и на колонку кремнезема и вымойте предоставленным буфером.
Отбросьте поток через и повторить мыть с другими соответствующими буферами, с 30 секунд центрифуг между ними, отбрасывая ваш поток через после каждого. В конце концов, центрифуга в течение двух минут больше, чтобы удалить любой остаточный этанол и elute плазмид в 20 микролитров элюционного буфера и определить количество и качество по спектрофотометру. Теперь пришло время настроить ограничение пищеварения вектора и вставки.
Добавьте 625 нанограмм ДНК, вектор или вставку, пять микролитров буфера CutSmart, один микролитр SacII, один микролитр hindIII и реакцию с водой, чтобы довести окончательный объем реакции до 50 микролитров. Инкубировать ограничение переваривает на 37 по Цельсию в течение трех часов, а затем 80 по Цельсию в течение 20 минут, чтобы нагреть и активировать ферменты. На этом этапе, дайджесты могут храниться на четыре градуса, прежде чем перейти к следующему шагу.
Далее, мы собираемся создать 15 микролитров перевязки с использованием нашего переваренного геномного фрагмента, а также вектор, который мы только что завершили. Начнем с добавления шести микролитров воды. Мы добавим два микролитера нашего переваренного вектора.
Это наша плазмида pRS315. Мы добавим четыре микролитера нашей вставки, ген SIR2. Мы добавим два микролитера нашего буфера лигазы, если будет буфер 10X.
И, наконец, мы добавим один микролитер лигазы. Мы собираемся инкубировать это при 16 градусах за ночь, а затем тепло убить фермента при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Чтобы экран для нашей успешно созданной плазмиды, мы собираемся превратить его в E.coli.
Мы собираемся использовать 50 микролитров химически компетентных клеток. Мы разморозим их на льду, и как только они оттаяют, мы добавим нашу реакцию перевязки, мы добавим все ее содержимое. Итак, мы добавим 15 микролитров перевязки с вставкой, и мы добавим 15 микролитров нашего управления без вставки, а также к отдельной реакции.
После того, как он был добавлен, Флик трубки несколько раз, чтобы смешать его. И мы собираемся инкубировать это на льду. После завершения 30-минутной инкубации на льду, мы собираемся добавить наши образцы в 42-градусный отопительный блок, где мы будем инкубировать и тепловой удар в течение 20 секунд, в какой момент мы будем принимать их, и мы добавим восстановления средств массовой информации.
После теплового удара, мы собираемся, чтобы для периода восстановления. Мы собираемся взять наши образцы, и мы добавим 450 микролитров SOC средств массовой информации. Мы будем инкубировать их на 37 градусов по Цельсию, чтобы плазмиды, которые будут подобраны и позволить ген устойчивости ампициллина, чтобы начать быть выражены.
Мы позволим этим образцам восстанавливаться при 37 градусах в течение 45 минут. После этого инкубации, мы создали серию разбавлений, от одного до 10, и от одного до 100, и мы собираемся пластины этих на LB / Amp средств массовой информации и позволить клеткам расти в одночасье. Мы будем пластины их с помощью стерильной техники.
Мы возьмем соответствующую пластину, которую мы помечены соответствующим образом и содержит наш выбираемый маркер. Мы возьмем 150 микролитров нашего преобразованного E.coli. Используя стерильную инокулятивную петлю, мы затем аккуратно распределим клетки по всей и по всей пластине, чтобы получить хорошее равномерное распределение.
Как только мы закончили покрытие всех наших разбавлений, мы будем инкубировать эти пластины на ночь на 37 градусов по Цельсию, чтобы увидеть, что растет. Примерно через день, мы должны увидеть колоний растут, что мы надеемся содержать плазмид мы пытались создать. Они должны выглядеть что-то вроде этого.
Используя стерильную технику, привить потенциальные трансформаторы, которые выросли из вашего преобразования в пять миллилитров LB плюс ампициллин после ранее изложенной процедуры. Изолировать плазмиды от каждого потенциального трансформанта и запустить пищеварение ограничения, как описано ранее. Запустите реакционной продукции на агарозный гель, сравнивая потенциальные трансформаторы с пустым вектором.
Сохранить любые трансформаторы, которые приводят к иссечению правильного размера вставки для дальнейшего изучения. Успешно создав нашу плазмиду, мы собираемся превратить ее в нулевой дрожжевой фон ATG1. Мы возьмем 15 миллионов клеток и заграем их, что я уже сделал прямо здесь.
После того как они гранулы, удалить YPAD средств массовой информации, что они растут в и мыть клетки с дистиллированной водой. После этого, мы собираемся взять клетки, и мы собираемся повторно использовать их в 100 миллимолейных ацетата лития. Мы собираемся повторно использовать их в 200 микролитров этого.
Resuspend гранулы клетки нежным pipetting вверх и вниз. Разделите клетки на отдельные трубки микротехи для каждого из преобразований, которые вы будете выполнять, используя 50 микролитров этой смеси за преобразование. К каждому из преобразований необходимо добавить 240 микролитров 50% PEG.
PEG очень вязкий, пипетка и мера очень тщательно. Смешайте путем пипетки после добавления PEG и после каждого из дополнительных компонентов. Далее добавьте 36 микролитров одного молярного литиевого ацетата, пять микролитров ДНК спермы лосося или другую ДНК носителя, которая варилась в течение пяти минут и помещена на лед, и, наконец, пять микролитров плазмиды для каждой трансформации, которую вы будете выполнять.
Vortex каждой трубки тщательно перемешать. Инкубировать образцы при 30 градусах по Цельсию в течение 45 минут. Тепло ударяет их на 42 по Цельсию в течение 10 минут, а затем мыть клетки один раз в стерильной воде, наконец, повторно их в 200 микролитров стерильной воды.
Установите от одного до 10 и от одного до 100 разбавления каждого из преобразованных штаммов дрожжей и пластины 150 микролитров на SC минус пластины лея, чтобы выбрать для плазмидов. Распространение клеток равномерно и равномерно, и позволяют пластины высохнуть перед инвертированием и инкубации их при 30 градусов по Цельсию, что позволяет им расти в течение 48 до 72 часов. Как только мы успешно клонируем наш ген для тестирования, мы тестируем влияние на хронологическую продолжительность жизни организма.
Мы будем выращивать дрожжи, отслеживая количество жизнеспособных колоний, образующих единицы, которые остаются в качестве функции времени. Выращиваем дрожжи сначала в течение 72 часов в SC минус лейкин жидких средств массовой информации с тряской при температуре 30 градусов по Цельсию. Используя гемоцитометр, определите разбавление, необходимое, чтобы позволить вам пластины 500 клеток.
Используя стерильную технику, пластины клеток на SC минус лей пластины, что позволяет ему высохнуть и инкубировать перевернутый в течение трех дней при температуре 30 градусов по Цельсию, в этот момент они будут расти, и вы можете оценка роста колонии и записывать, что точка времени. После изготовления пластины, продолжать инкубировать дрожжи при 30 градусах по Цельсию без тряски. Первоначально мы повторяем покрытие через еженедельные промежутки времени, принимая более частые точки времени, если наши предварительные данные свидетельствуют о подавлении старения фенотипа.
Для того, чтобы определить процент жизнеспособности, мы нормализуем в день один раз точки для анализа. Не забудьте пластины же разбавления на каждом интервале. Продолжайте этот процесс, пока вы больше не увидите каких-либо колоний растут.
Полезно ввести вашу информацию в электронную таблицу Excel. Это позволит быстро определить жизнеспособность каждого штамма по завершении эксперимента.
