Das Altern ist durch die zeitabhängige Verschlechterung mehrerer zellulärer Prozesse gekennzeichnet, die letztlich die Wahrscheinlichkeit eines Organismustodes erhöht. Innerhalb einer Population ist dieser Prozess variabel und eine Reihe von genetischen und Umweltfaktoren können ihn beeinflussen. Eine der am besten untersuchten und verstandenen Variablen ist die Rolle der Ernährung auf die Lebensdauer.
Ernährungseinschränkung ist eine Intervention, die letztlich den Beginn von Alterung und Alterung-assoziierten Veränderungen verzögert. Dies erhöht die Lebensdauer und Die Gesundheitsspanne eines Organismus oder die Dauer, wenn ein Organismus ein normales, gesundes Leben hat. Unser gegenwärtiges Verständnis hat zur Identifizierung einer reihe von zellulären Veränderungen geführt, die als Kennzeichen des Alterns bezeichnet wurden, wie die Anhäufung von Mutationen, Dysregulation von Telotoren, ein Verlust von Proteinhomöostase, Atmungsprobleme und reaktive Sauerstoffspezies, unter anderem.
Nun stammt ein Großteil dieses Verständnisses aus Studien, die viele verschiedene Modellorganismen verwenden. Es gab viele genetische Screens, die Gene identifiziert haben, die sowohl verkürzen als auch die Lebensdauer verlängern. Und dazu gehören Studien in der angehenden Hefe Saccharomyces cerevisiae, die der Schwerpunkt dieser Methodik ist, sowie Studien an komplexeren mehrzelligen Organismen, wie C.elegans und dem murinen System.
Von diesen ist die aufkeimende Hefe aufgrund ihrer kurzen natürlichen Lebensdauer und einer Reihe genetischer Ansätze, die die komplexen genetischen Beziehungen auflösen können, besonders für Alterungsstudien geeignet, was sie zu einem ausgezeichneten System für die funktionelle Zerlegung der Genetik des Alterns macht. Hefe kann verwendet werden, um mehrere verschiedene Aspekte des Alterns zu studieren. Und wir werden uns auf die chronologische Lebensdauer konzentrieren, die die Dauer ist, die eine Zelle überleben kann.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, einen einfachen genetischen Ansatz zu präsentieren, um einen Bildschirm mit Überexpressionsuppressor durchzuführen. Wir werden einen genetischen Hintergrund nutzen, der zu einer ungewöhnlich verkürzten chronologischen Lebensdauer führt. Und wir werden einen gezielten Ansatz verwenden, um Gene zu identifizieren, die den verkürzten Phänotyp der Lebensdauer retten oder unterdrücken können, und versuchen, Gene zu identifizieren, die eine normale Lebensdauer wiederherstellen.
Der erste genetische Hintergrund ist ein autophagy-mangelhafter Hefestamm. Autophagie, die lose als selbstfressend übersetzt wird, ist ein intrazelluläres Abbausystem, um zytosolische Produkte wie Proteine und Organellen an das Lysosom zu liefern. Dies hilft, zelluläre Homöostase durch die Beseitigung von beschädigten Proteinen zu erhalten, sowie diejenigen, die ihr Leben überlebt haben.
Wir werden mit einem mutierten Stamm arbeiten, der das ATG1-Gen löscht. ATG1-Codes für eine Proteinserin/Threonin-Protein-Kinase, die für die Vesikelbildung und Autophagie im Zytoplasma-zu-Vakuol-Targeting-Signalweg erforderlich ist. Der ATG1 Nullmutant hat einen Phänotyp mit einer ungewöhnlich kurzen chronologischen Lebensdauer.
In diesem Alterungslabor entwerfen und testen wir genetische Faktoren, die die ungewöhnlich verkürzte Lebensdauer des ATG1 Nullmutanten retten oder unterdrücken können. Dies kann jedoch auch auf andere kurzlebige genetische Hintergründe ausgedehnt werden. Der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, ein Gen zu identifizieren, das mit der Verlängerung der Lebensdauer verbunden ist.
Wir werden uns speziell auf die Gene konzentrieren, die die chronologische Lebensdauer verlängern, wenn sie überexprimiert werden. Dazu werden wir die öffentlich zugänglichen Daten verwenden, auf die aus der Hefegenom-Datenbank zugegriffen werden kann. Wir werden hier hinaufgehen.
Suche nach Phänotyp. Und etwa auf halbem Weg werden wir sehen, dass wir die chronologische Lebensdauer auswählen können. Um nach Genen zu suchen, die die Lebensdauer erhöhen, können Sie die Fülle der verfügbaren Daten sehen, die Gene haben, die mit diesem speziellen Phänotyp verbunden sind.
Heute werden wir SIR2 studieren, eine Histonlysin-Deacetylase, die mit einer längeren chronologischen Lebensdauer verbunden ist, wenn sie überexprimiert wird. Das erste, was wir tun werden, ist der Zugriff auf die DNA-Sequenz für die Kodierungsregion sowie die regulatorischen Regionen, die beide Seiten dieses Gens flankieren. Wir werden 400 Basispaare strom- und stromabwärts nehmen, um sicherzustellen, dass wir alle regulatorischen Regionen umfassen.
Wir werden diese DNA-Sequenz verwenden, um PCR-Primer zu entwerfen, die es uns ermöglichen, dieses Gen in unseren Plasmidvektor zu klonen. Wir werden PCR verwenden, um unser Gen zu verstärken und es in den pRS315-Vektor zu klonen. Um dies zu tun, werden wir Primer entwerfen, die Restriktionsvergärungsstellen enthalten, die HindIII- und SacII-Beschränkungsstandorte enthalten.
Wie Sie sehen können, enthält das Plasmid beide Restriktionsstellen, HindIII und SacII, die unser Klonen erleichtern werden. Sie sollten Ihre PCR-Primer so entwerfen, dass sie etwa 21 oder 22 Sequenznukleotide enthalten, die für die Region, die Sie verstärken möchten, kostenlos sind. Zusätzlich zur Sequenz fügen Sie auf dem fünf Hauptende von ihnen die entsprechende Restriktionsstelle hinzu, entweder HindIII auf der Vorwärtsgrundierung oder SacII auf der umgekehrten Grundierung, die hier in Rot bzw. Violett dargestellt ist, und weiter vorgelagert, fügen Sie mehrere Nukleotide hinzu, die es dem Restriktionsenzym ermöglichen, die Restriktionsstelle mit einer höheren Effizienz zu binden und zu erstellen.
Wachsen Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur der wilden Art Hefe über Nacht zu Post-Log-Phase in angereicherten Medien, wie YPAD. Ernten Sie genomische DNA mit einem handelsüblichen Kit, das spezifisch für die genomische Pilzisolierung ist. Es ist wichtig, dass das Kit spezifisch für Hefe ist, da sie eine sehr steife und harte Zellwand zu durchdringen haben.
Die Zymolyse-Behandlung ist wirksam bei der Verdauung der Zellwand und erhöht die genomische Ausbeute erheblich. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Menge und die Qualität der DNA zu bestimmen. Um ein Amplicon zu produzieren, das zum Klonen geeignet ist, ist es notwendig, eine hochtreue PCR-Polymerase zu verwenden, um Mutationen während des Amplifikationsprozesses zu vermeiden.
Es gibt viele verschiedene High-Fidelity-PCR-Kits, die im Handel erhältlich sind. Um die Optimierung der Reaktion zu erleichtern, empfehlen wir die Auswahl eines Kits, das mehrere Puffersysteme bietet, eines, das ein Standardpuffer mit hoher Genauigkeit ist und für einen hohen GC-Gehalt in komplexen Amplicons optimiert ist. Wir werden 200 Nanogramm unserer genomischen DNA hinzufügen.
Wir werden fünf Mikroliter unseres Puffers hinzufügen. Wir werden 2 1/2 Mikroliter unserer Vorwärts- und Rückgrundierungen hinzufügen. Wir werden einen Mikroliter unserer Polymerase hinzufügen, zwei Mikroliter D NTPs.
Und schließlich werden wir die ganze Reaktion auf 50 Mikroliter mit sterilem destilliertem Wasser VERfeinern. Wir führen die Reaktion gemäß dem Protokoll speziell für das Enzym, das wir verwenden, sowie für die Primer aus, die wir in diesem Experiment entwickelt haben. Bereinigen und konzentrieren Sie die PCR-Reaktion.
Wachsen Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur von E.coli über Nacht in selektiven Medien. Pellet die Kultur durch Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand. Resuspend ieren und lysieren Sie die Zellen im bereitgestellten chaotropen Puffer für fünf Minuten.
Neutralisieren Sie die Reaktion und mischen Sie die beiden durch Inversion fünf oder sechs Mal. Zentrifugieren Sie Ihre Probe für 10 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit. Den Überstand in eine Kieselsäuresäule überführen und mit dem mitgelieferten Puffer waschen.
Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie die Wäsche mit den anderen geeigneten Puffern, mit 30 Sekunden Zentrifugationen dazwischen, indem Sie Ihren Durchfluss nach jedem zurückwerfen. Am Ende zentrifugieren Sie für zwei Minuten mehr, um restliches Ethanol zu entfernen und Ihr Plasmid in 20 Mikroliter Elutionspuffer zu löschen und die Menge und Qualität durch Spektralphotometer zu bestimmen. Jetzt ist es an der Zeit, eine Einschränkungsverdauung des Vektors und des Inserts einzurichten.
Fügen Sie 625 Nanogramm DNA hinzu, entweder den Vektor oder den Einsatz, fünf Mikroliter CutSmart-Puffer, einen Mikroliter SacII, einen Mikroliter HindIII und QS die Reaktion mit Wasser, um das endgültige Reaktionsvolumen auf 50 Mikroliter zu bringen. Inkubieren Sie die Einschränkung verdauungsfördern bei 37 Grad Celsius für drei Stunden, gefolgt von 80 Grad Celsius für 20 Minuten, um die Enzyme zu erhitzen und zu aktivieren. An diesem Punkt können Digests bei vier Grad gespeichert werden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Als nächstes werden wir eine 15 Mikroliter Ligation mit unserem verdauten genomischen Fragment sowie dem Vektor einrichten, den wir gerade abgeschlossen haben. Wir beginnen mit sechs Mikroliter Wasser. Wir werden zwei Mikroliter unseres verdauten Vektors hinzufügen.
Dies ist unser pRS315 Plasmid. Wir werden vier Mikroliter unseres Inserts hinzufügen, das SIR2-Gen. Wir werden zwei Mikroliter unseres Ligase-Puffers hinzufügen, falls der 10-fache Puffer.
Und schließlich werden wir einen Mikroliter der Ligase hinzufügen. Wir werden dies bei 16 Grad über Nacht inkubieren, und dann Hitze töten das Enzym bei 80 Grad Celsius für 20 Minuten. Um unser erfolgreich erstelltes Plasmid zu überprüfen, werden wir es in E.coli umwandeln.
Wir werden 50 Mikroliter chemisch kompetenter Zellen verwenden. Wir werden sie auf Eis auftauen, und sobald sie auftauen, werden wir unsere Ligationsreaktion hinzufügen, wir werden den gesamten Inhalt hinzufügen. Also werden wir 15 Mikroliter der Ligation mit dem Einsatz hinzufügen, und wir werden 15 Mikroliter unserer No-Insert-Steuerung sowie eine separate Reaktion hinzufügen.
Sobald es hinzugefügt wurde, streichen Sie die Röhre ein paar Mal, um es zu mischen. Und wir werden dies auf Eis bebrüten. Nachdem wir die 30-minütige Inkubation auf Eis abgeschlossen haben, werden wir unsere Proben in einen 42-Grad-Heizblock einzahlen, wo wir 20 Sekunden lang inkubieren und einen Hitzeschock auslösen werden, an welchem Punkt wir sie herausnehmen werden, und wir werden Wiederherstellungsmedien hinzufügen.
Nach dem Hitzeschock werden wir eine Erholungsphase ermöglichen. Wir werden unsere Proben nehmen und 450 Mikroliter SOC-Medien hinzufügen. Wir werden diese bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit die Plasmide aufgenommen werden können und das Ampicillin-Resistenzgen exprimiert werden kann.
Wir werden zulassen, dass sich diese Proben 45 Minuten lang bei 37 Grad erholen. Nach dieser Inkubation haben wir eine Reihe von Verdünnungen eingerichtet, eine bis 10 und eins bis 100, und wir werden diese auf LB/Amp-Medien plattieren und die Zellen über Nacht wachsen lassen. Wir werden sie mit steriler Technik plattieren.
Wir nehmen die entsprechende Platte, die wir entsprechend beschriftet haben und enthält unseren wählbaren Marker. Wir nehmen 150 Mikroliter unseres transformierten E.coli. Mit einer sterilen Impfschleife verteilen wir dann die Zellen sanft über und über die gesamte Platte, so dass wir eine schöne gleichmäßige Verteilung erhalten.
Sobald wir alle unsere Verdünnungen plattiert haben, werden wir diese Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten, um zu sehen, was wächst. Nach etwa einem Tag sollten wir Kolonien aufwachsen sehen, die hoffentlich das Plasmid enthalten, das wir zu erschaffen versuchten. Sie sollten so aussehen.
Mit steriler Technik, impfen potenzielle Transformationsmittel, die aus Ihrer Umwandlung in fünf Milliliter LB plus Ampicillin nach dem zuvor beschriebenen Verfahren wuchs. Isolieren Sie die Plasmide von jedem potenziellen Transformant und führen Sie eine Einschränkungsverdauung aus, wie zuvor beschrieben. Führen Sie die Reaktionsprodukte auf einem Agarose-Gel aus und vergleichen Sie die potentiellen Transformationsmittel mit dem leeren Vektor.
Speichern Sie alle Transformanten, die zur Exzision eines richtig dimensionierten Inserts führen, für weitere Untersuchungen. Nachdem wir unser Plasmid erfolgreich erstellt haben, werden wir es in den ATG1 Null-Hefe-Hintergrund umwandeln. Wir werden 15 Mils Zellen nehmen und wir werden sie pellet, was ich hier bereits getan habe.
Nachdem sie pelletiert haben, entfernen Sie die YPAD-Medien, in denen sie wuchsen, und waschen Sie die Zellen mit destilliertem Wasser. Danach werden wir die Zellen nehmen und sie in 100 Millimolar-Lithiumacetat wieder aussetzen. Wir werden sie in 200 Mikroliterdavon wieder aussetzen.
Setzen Sie das Zellpellet durch sanftes Pipettieren nach oben und unten aus. Teilen Sie die Zellen in separate Mikrofugenröhren für jede der Transformationen, die Sie durchführen werden, mit 50 Mikrolitern dieser Mischung pro Transformation. Zu jeder Transformation müssen Sie 240 Mikroliter 50% PEG hinzufügen.
PEG ist sehr zähflüssig, Pipette und messen sehr sorgfältig. Mischen Sie durch Pipettiernachdurchbau nach dem Zusatz des PEG und nach jeder der zusätzlichen Komponenten. Als nächstes fügen Sie 36 Mikroliter eines Mol-Lithiumacetats, fünf Mikroliter Lachs-Sperma-DNA oder andere Träger-DNA hinzu, die fünf Minuten lang gekocht und auf Eis gelegt wurde, und schließlich fünf Mikroliter des Plasmids für jede Transformation, die Sie durchführen werden.
Wirbel jede Röhre gründlich zu mischen. Inkubieren Sie Ihre Proben bei 30 Grad Celsius für 45 Minuten. Hitze schockt sie bei 42 Grad Celsius für 10 Minuten, und dann waschen Sie die Zellen einmal in sterilem Wasser, schließlich wieder aufhängen sie in 200 Mikroliter sterilen Wasser.
Richten Sie ein bis zehn und ein bis 100 Verdünnungen jeder der transformierten Stämme von Hefe und Platte 150 Mikroliter auf SC minus Leu-Platten ein, um sie für die Plasmide auszuwählen. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig und gleichmäßig, und lassen Sie die Platten trocknen, bevor sie invertieren und inkubieren sie bei 30 Grad Celsius, so dass sie für 48 bis 72 Stunden wachsen. Sobald wir unser Gen erfolgreich geklont haben, um es zu testen, werden wir die Auswirkungen auf die chronologische Lebensdauer des Organismus testen.
Wir werden die Hefe anbauen und die Anzahl lebensfähiger Kolonien bildender Einheiten überwachen, die als Funktion der Zeit erhalten bleiben. Wachsen Sie die Hefe zuerst für 72 Stunden in SC minus Leucin flüssige Medien mit Schütteln bei 30 Grad Celsius. Bestimmen Sie mit einem Hämozytometer die Verdünnung, die notwendig ist, damit Sie 500 Zellen plattieren können.
Mit steriler Technik, platte die Zellen auf eine SC minus Leu-Platte, so dass es zu trocknen und inkubieren für drei Tage bei 30 Grad Celsius, an diesem Punkt werden sie wachsen und Sie können die Kolonie Wachstum und Aufzeichnung, dass Zeitpunkt. Nach der Herstellung der Platte, weiterhin Ihre Hefe bei 30 Grad Celsius ohne schütteln inkubieren. Zunächst wiederholen wir die Beschichtung in wöchentlichen Abständen, wobei wir häufigere Zeitpunkte nehmen, wenn unsere vorläufigen Daten auf eine Unterdrückung des alternden Phänotyps hindeuten.
Um die prozentuale Lebensfähigkeit zu bestimmen, normalisieren wir für die Analyse einen Zeitpunkt auf den Tag. Achten Sie darauf, die gleiche Verdünnung in jedem Intervall zu verschildern. Fahren Sie mit diesem Prozess fort, bis Sie keine Kolonien mehr aufwachsen sehen.
Es ist hilfreich, Ihre Informationen in eine Excel-Tabelle einzugeben. Auf diese Weise können Sie am Ende des Experiments schnell die Lebensfähigkeit jedes Stammes bestimmen.
