يتميز الشيخوخة بالتدهور الذي يعتمد على الوقت في العمليات الخلوية المتعددة التي تزيد في نهاية المطاف من احتمال موت الكائنات الحية. وفي إطار السكان، تكون هذه العملية متغيرة ويمكن أن يؤثر عليها عدد من العوامل الوراثية والبيئية. واحدة من أفضل المتغيرات درس وفهم هو دور النظام الغذائي على عمر.
تقييد النظام الغذائي هو التدخل الذي يؤخر في نهاية المطاف ظهور الشيخوخة والتغيرات المرتبطة بالشيخوخة. وهذا يزيد من عمر الكائن الحي ومدى صحته، أو طول الوقت عندما يكون للكائن الحي حياة طبيعية وصحية. وقد أدى فهمنا الحالي إلى تحديد مجموعة متميزة من التغيرات الخلوية التي تم تسميتها ببصمات الشيخوخة ، مثل تراكم الطفرات ، وخلل تنظيم التيلوميرات ، وفقدان التوازن البروتيني ، ومشاكل التنفس ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ، من بين أمور أخرى.
الآن يأتي الكثير من هذا الفهم من الدراسات التي تستخدم العديد من الكائنات الحية النموذجية المختلفة. كانت هناك العديد من الشاشات الوراثية التي حددت الجينات التي تختصر وتمدد العمر. وتشمل هذه الدراسات في خميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae، الذي هو محور هذه المنهجية، فضلا عن دراسات في الكائنات الحية متعددة الخلايا أكثر تعقيدا، مثل C.elegans ونظام مورين.
على الرغم من هذه، والخميرة في مهدها هو قابل بشكل خاص لدراسات الشيخوخة بسبب عمرها الطبيعي القصير وعدد من النهج الجينية التي يمكن كشف العلاقات الوراثية المعقدة، مما يجعلها نظاما ممتازا للتشريح الوظيفي لعلم الوراثة من الشيخوخة. الخميرة يمكن استخدامها لدراسة عدة جوانب مختلفة من الشيخوخة. وسوف نركز على عمر زمني، وهي المدة التي يمكن أن تبقى الخلية.
والهدف من هذا العمل هو تقديم نهج وراثي مباشر لأداء شاشة القامع المفرطة في التعبير. سوف نستخدم خلفية وراثية تؤدي إلى تقصير عمر زمني غير طبيعي. وسوف نستخدم نهجاً مستهدفاً لتحديد الجينات التي يمكنها إنقاذ أو قمع النمط الظاهري القصير للأعمار، في محاولة لتحديد الجينات التي تستعيد عمرها الطبيعي.
الخلفية الجينية الأولى هي سلالة ناقصة من الخميرة. Autophagy، الذي يترجم بشكل فضفاض على أنه تناول الطعام الذاتي، هو نظام تدهور داخل الخلايا لتقديم المنتجات الخلوية، مثل البروتينات والعضيات، إلى الليسوسوم. وهذا يساعد على الحفاظ على التوازن الخلوي من خلال القضاء على البروتينات التالفة، فضلا عن تلك التي قد عمرها حياتهم.
سوف نعمل مع سلالة متحولة التي لديها حذف الجين ATG1. رموز ATG1 للبروتين سيرين / ثريونين البروتين كيناز المطلوبة لتشكيل الفينة وautophagy في مسار استهداف السيتوبلازم إلى vacuole. يحتوي متحولة فارغة ATG1 نمط ظاهري من وجود عمر زمني قصير بشكل غير طبيعي.
في هذا المختبر الشيخوخة، وسوف نقوم بتصميم واختبار العوامل الوراثية التي يمكن إنقاذ، أو قمع، سمة تقصير غير طبيعي من عمر متحولة فارغة ATG1. ومع ذلك، يمكن توسيع نطاق هذا إلى خلفيات وراثية قصيرة الأجل أخرى أيضا. الخطوة الأولى في هذه العملية هي تحديد الجين المرتبط بإطالة العمر.
سنركز بشكل خاص على الجينات التي تمتد العمر الزمني عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط. للقيام بذلك، نحن ذاهبون إلى استخدام البيانات المتاحة للجمهور التي يمكن الوصول إليها من قاعدة بيانات الجينوم الخميرة. سنذهب إلى هنا
البحث حسب النمط الظاهري. وفي منتصف الطريق، سنرى يمكننا تحديد عمر زمني. للبحث عن الجينات التي تزيد من عمر، ما يمكنك أن تراه هو ثروة من البيانات المتاحة التي لديها جينات مرتبطة بهذا النمط الظاهري خاصة.
اليوم، سوف ندرس SIR2، وهو deacetylase histone lysine التي ترتبط عمر زمني ممتد عندما يتم الإفراط في التعبير عنها. أول شيء سنفعله هو الوصول إلى تسلسل الحمض النووي لمنطقة الترميز ، وكذلك المناطق التنظيمية التي تحيط على جانبي هذا الجين. سوف نأخذ 400 زوج قاعدة من المنبع والمصب للتأكد من أننا نشمل جميع المناطق التنظيمية.
سنستخدم تسلسل الحمض النووي هذا لتصميم الـ PCR التمهيدية التي ستسمح لنا باستنساخ هذا الجين في متجهنا البلازمي سنستخدم PCR لتضخيم جيناتنا واستنساخها في المتجه pRS315. من أجل القيام بذلك، سنقوم بتصميم التمهيديات التي تحتوي على مواقع الهضم تقييد التي تتضمن مواقع تقييد HindIII و SacII.
كما ترون، البلازميد يحتوي على كل من المواقع تقييد، هند الثالث و SacII، من شأنها أن تسهل استنساخ لدينا. يجب عليك تصميم التمهيديات PCR الخاص بك لاحتواء حوالي 21 أو 22 نوكليوتيدات من تسلسل مجانية للمنطقة التي تريد تضخيم. بالإضافة إلى تسلسل، سوف تضيف على نهاية خمسة رئيس منهم موقع تقييد المناسبة، إما HindIII على التمهيدي إلى الأمام، أو SacII على التمهيدي العكسي، هو مبين هنا في الأحمر والأرجواني على التوالي، والمزيد من المنبع من ذلك، إضافة العديد من النيوكليوتيدات التي من شأنها أن تسمح إنزيم تقييد لربط وإنشاء موقع الهضم تقييد في كفاءة أعلى.
تنمو ثقافة خمسة ملليلتر من الخميرة نوع البرية بين عشية وضحاها لمرحلة ما بعد السجل في وسائل الإعلام المخصب، مثل YPAD. حصاد الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة المتاحة تجاريا التي هي محددة لعزل الجينوم الفطرية. من المهم أن تكون المجموعة محددة للخميرة ، حيث أن لديها جدار خلية جامدة وصعبة للغاية للاختراق.
علاج Zymolyase فعال في هضم جدار الخلية ويزيد بشكل كبير من العائد الجينومي. استخدم مقياس طيفي لتحديد كمية ونوعية الحمض النووي. لإنتاج تضخيم مناسب للاستنساخ ، من الضروري استخدام بوليميراز PCR عالي الدقة لتجنب الطفرات أثناء عملية التضخيم.
هناك العديد من مجموعات PCR عالية الدقة المختلفة المتاحة تجاريا. لتسهيل تحسين التفاعل ، نوصي باختيار مجموعة توفر أنظمة تخزين مؤقت متعددة ، واحدة هي مخزن قياسي عالي الدقة ، وواحد محسن لمحتوى GC العالي في amplicons المعقدة. سوف نضيف 200 نانوجرام من الحمض النووي الجينومي لدينا.
سوف نضيف خمسة ميكروليترات من المخزن المؤقت لدينا سنقوم بإضافة 2 1/2 ميكرولترات من الأمام لدينا واناعها عكس. سوف نضيف ميكرولتر واحد من البوليميراز لدينا، اثنين من microliters من D NTPs.
وأخيرا، نحن ذاهبون إلى QS رد فعل كامل ل50 ميكرولترات مع الماء المقطر العقيمة. سنقوم بتشغيل رد الفعل وفقا للبروتوكول المحدد للانزيم الذي نستخدمه، وكذلك ل التمهيديات التي قمنا بتصميمها في هذه التجربة. تنظيف وتركيز تفاعل PCR.
تنمو ثقافة خمسة ملليلتر من الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام الانتقائية. بيليه الثقافة عن طريق الطرد المركزي وتجاهل supernatant. Resuspend وlyse الخلايا في المخزن المؤقت chaotropic المقدمة لمدة خمس دقائق.
تحييد رد الفعل وخلط اثنين عن طريق عكس خمس أو ست مرات. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق في السرعة القصوى. نقل supernatant وإلى عمود السيليكا وغسل مع المخزن المؤقت المقدمة.
تجاهل تدفق من خلال وتكرار غسل مع المخازن المؤقتة المناسبة الأخرى، مع 30 ثانية الطرد المركزي في ما بين، والتخلص من تدفق الخاص بك من خلال بعد كل. في النهاية، الطرد المركزي لمدة دقيقتين أكثر لإزالة أي الإيثانول المتبقية و elute plasmid الخاص بك في 20 ميكروليترس عازلة elution وتحديد الكمية والنوعية بواسطة مقياس الطيف. الآن حان الوقت لإعداد هضم تقييد للمتجه وإدراج.
إضافة 625 نانوغرام من الحمض النووي، إما المتجه أو إدراج، خمسة ميكرولتررس من العازلة CutSmart، واحد ميكرولتر من SacII، ميكرولتر واحد من HindIII، وQS رد فعل مع الماء لتحقيق حجم التفاعل النهائي إلى 50 ميكرولتر. احتضان هضمات تقييد في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات، تليها 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتسخين وتنشيط الانزيمات. عند هذه النقطة، يمكن تخزين هضمات في أربع درجات قبل الشروع في الخطوة التالية.
بعد ذلك، سنقوم بإعداد 15 ميكرولتر الربط باستخدام لدينا هضم جزء الجينوم، فضلا عن ناقلات التي أكملنا للتو. سنبدأ بإضافة ستة ميكرولترات من الماء سوف نضيف اثنين من ميكرولترات من متجهنا المهضم.
هذا هو لدينا pRS315 plasmid. سنضيف أربعة ميكرولترات من مُدخلنا، جين السير2. نحن ذاهبون لإضافة اثنين microliters لدينا العازلة الرباط ، القضية العازلة 10X.
وأخيراً، سنضيف ميكرولتر واحد من الرباط. سنحتضن هذا في 16 درجة بين عشية وضحاها، ثم الحرارة تقتل الإنزيم في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لشاشة لدينا بنجاح خلق plasmid، ونحن في طريقنا لتحويلها إلى الإشريكية القولونية.
سوف نستخدم 50 ميكرولترات من الخلايا المختصة كيميائياً سنذيبهم على الجليد، وحالما يذوبون، سنضيف رد فعل الربط، سنضيف كامل محتوياته. لذلك نحن ذاهبون لإضافة 15 ميكرولترات من الربط مع إدراج، ونحن في طريقنا لإضافة 15 ميكرولترات من لدينا عدم إدراج السيطرة وكذلك إلى رد فعل منفصل.
بمجرد إضافتها ، ونفض الغبار الأنبوب عدة مرات من أجل مزجه. وسنحتضن هذا على الجليد بعد الانتهاء من حضانة 30 دقيقة على الجليد، ونحن في طريقنا لإضافة عينات لدينا في كتلة التدفئة 42 درجة حيث سنقوم احتضان وصدمة الحرارة لمدة 20 ثانية، والتي نقطة سوف نأخذ بها، وسوف نضيف وسائل الإعلام الانتعاش.
بعد الصدمة الحرارية، سنسمح بفترة نقاهة. نحن ذاهبون إلى أخذ عينات لدينا وسوف نضيف 450 microliters من وسائل الإعلام SOC. سنقوم احتضان هذه في 37 درجة مئوية للسماح البلازميدات ليتم التقاطها والسماح للجين مقاومة الأمبيسيلين أن تبدأ في التعبير عنها.
وسنسمح لهذه العينات بالتعافي عند درجة 37 لمدة 45 دقيقة. بعد هذا الحضانة، وضعنا سلسلة من التخفيفات، واحد إلى 10، وواحد إلى 100، ونحن في طريقنا إلى لوحة هذه على وسائل الإعلام LB / أمبير والسماح للخلايا أن يكبر بين عشية وضحاها. سنقوم بطبقة لهم باستخدام تقنية عقيمة.
سوف نأخذ اللوحة المناسبة، والتي قمنا بتسمية وفقا لذلك، وتحتوي على علامة اختيار لدينا. سنأخذ 150 ميكرولترات من كولاي المتحولة لدينا. باستخدام حلقة التلقيح العقيمة، ونحن ثم نشر بلطف الخلايا في جميع أنحاء وعبر لوحة بأكملها حتى نحصل على توزيع حتى لطيفة.
بمجرد الانتهاء من طلاء جميع عمليات التخفيف لدينا ، سنقوم باحتضان هذه اللوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لنرى ما ينمو. بعد يوم تقريباً، يجب أن نرى مستعمرات تكبر ونأمل أن تحتوي على البلازميد الذي كنا نحاول خلقه. يجب أن يبدوا هكذا
باستخدام تقنية معقمة، تلقيح التحويلات المحتملة التي نمت من التحول الخاص بك إلى خمسة ملليلتر LB بالإضافة إلى ampicillin بعد الإجراء المبين سابقا. عزل البلازميدات من كل تحويل المحتملة وتشغيل الهضم تقييد كما وصف سابقا. تشغيل منتجات التفاعل على هلام agarose، مقارنة التحويلات المحتملة إلى ناقل فارغ.
حفظ أي المحولات التي تؤدي إلى الختان من إدراج الحجم بشكل صحيح لمزيد من الدراسة. بعد أن نجحت في إنشاء بلازميد لدينا، ونحن نذهب لتحويلها إلى خلفية الخميرة فارغة ATG1. سنأخذ 15 مل من الخلايا و سنعيدها، وهو ما فعلته هنا
بعد أن كنت pelleted، وإزالة وسائل الإعلام YPAD التي كانوا ينمو في وغسل الخلايا بالماء المقطر. بعد ذلك، سنأخذ الخلايا و سنعيد تعليقها في 100 ملليمولار ليثيوم خلات. سنعيد اِنْتِكارهم في 200 ميكرولترات من ذلك
Resuspend بيليه الخلية عن طريق الأنابيب لطيف صعودا وهبوطا. تقسيم الخلايا إلى أنابيب صغيرة منفصلة لكل من التحولات التي سوف تؤديها، وذلك باستخدام 50 ميكرولترات من هذا المزيج لكل تحويل. إلى كل من التحولات، وسوف تحتاج إلى إضافة 240 ميكرولترات من 50٪ PEG.
الربط هو لزج جدا، ماصة وقياس بعناية فائقة. مزيج عن طريق الأنابيب بعد إضافة PEG وبعد كل واحد من مكونات إضافية. المقبل إضافة 36 microliters من خلات الليثيوم الضرس واحد، خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون، أو الحمض النووي الناقل الأخرى، التي تم غليها لمدة خمس دقائق ووضعها على الجليد، وأخيرا خمسة ميكرولترات من البلازميد لكل تحول سوف يكون أداء.
دوامة كل أنبوب جيدا لخلط. احتضان العينات الخاصة بك في 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. الحرارة صدمة لهم في 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ومن ثم غسل الخلايا مرة واحدة في الماء المعقم، وأخيرا إعادة تعليقها في 200 ميكرولتر من الماء المعقم.
اقامة واحد إلى 10 واحد إلى 100 dilutions من كل من تحول سلالات من الخميرة وطبقة 150 microliters على SC ناقص لوحات ليو لتحديد لبلازميدات. نشر الخلايا بشكل موحد ومتعادل، والسماح للألواح لتجف قبل عكس وتحتضن لهم في 30 درجة مئوية، مما يسمح لهم بالنمو لمدة 48 إلى 72 ساعة. بمجرد أن نستنسخ جيناتنا بنجاح لاختبارها، سنختبر التأثير على العمر الزمني للكائن الحي.
سوف نزرع الخميرة، ورصد عدد من وحدات تشكيل مستعمرة قابلة للحياة التي تبقى بمثابة دالة من الزمن. تنمو الخميرة الأولى لمدة 72 ساعة في SC ناقص وسائط سائلة ليوسين مع اهتزاز في 30 درجة مئوية. باستخدام مقياس الهيموزيت، تحديد التخفيف اللازم للسماح لك لوحة 500 الخلايا.
باستخدام تقنية معقمة، لوحة الخلايا على لوحة SC ناقص ليو، مما يسمح لها لتجف واحتضان مقلوب لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية، وعند هذه النقطة أنها سوف يكبر ويمكنك تسجيل نمو مستعمرة وتسجيل تلك النقطة الزمنية. بعد جعل لوحة، والاستمرار في احتضان الخميرة الخاصة بك في 30 درجة مئوية دون اهتزاز. في البداية، نكرر الطلاء على فترات أسبوعية، مع أخذ نقاط زمنية أكثر تواترا إذا كانت بياناتنا الأولية تشير إلى قمع النمط الظاهري الشيخوخة.
من أجل تحديد نسبة البقاء في المئة، ونحن تطبيع إلى نقطة وقت واحد لتحليل. تأكد من لوحة نفس التخفيف في كل فترة زمنية. استمر في هذه العملية حتى لا ترى أي مستعمرات تكبر.
من المفيد إدخال معلوماتك في جدول بيانات Excel. وهذا سوف يسمح لك بسرعة تحديد صلاحية كل سلالة في ختام التجربة.
