老化は、最終的に生物死亡の確率を増加させる複数の細胞プロセスの時間依存的な悪化によって特徴付けられる。集団内では、このプロセスは可変であり、多くの遺伝的および環境的要因がそれに影響を与える可能性があります。最もよく研究され、理解された変数の一つは、寿命に対する食事の役割です。
食事制限は、最終的に老化と加齢に伴う変化の発症を遅らせる介入である。これは、生物の寿命と健康寿命、または生物が正常で健康的な生活を持っている時間の長さを増加させます。我々の現在の理解は、突然変異の蓄積、テロメアの調節緩和、タンパク質ホメロスの喪失、呼吸障害、活性酸素種など、老化の特徴と呼ばれる細胞変化の明確なセットの同定につながっています。
今、この理解の多くは、多くの異なるモデル生物を使用する研究から来ています。寿命を短くし、寿命を延ばす遺伝子を同定した多くの遺伝子スクリーンがありました。これには、この方法論の焦点である出芽酵母サッカロミセス・セレビシエの研究や、C.elegansやマウスシステムのようなより複雑な多細胞生物の研究が含まれます。
しかし、これらの中で、出芽酵母は、その短い自然寿命と複雑な遺伝的関係を解明することができる遺伝的アプローチの数のために老化研究に特に適しており、老化の遺伝学の機能的解剖のための優れたシステムとなっています。酵母は、老化のいくつかの異なる側面を研究するために利用することができる。そして、私たちは、細胞が生き残ることができる期間である時系列の寿命に焦点を当てます。
本研究の目的は、過剰発現抑制画面を実行するための簡単な遺伝的アプローチを提示することにある。時系列寿命が異常に短くなる遺伝的背景を利用します。そして、標的型アプローチを利用して、寿命の短縮表現型を救出または抑制できる遺伝子を同定し、正常な寿命を回復させる遺伝子を同定しようとします。
最初の遺伝的背景は、酵母のオートファジー欠乏株である。オートファジーは、ゆるやかに自己食と訳され、細胞内分解システムであり、タンパク質やオルガネラなどの細胞質製品をリソソームに送達します。これは、損傷したタンパク質だけでなく、彼らの人生を超えているものを排除することによって細胞の恒常性を維持するのに役立ちます。
ATG1遺伝子の欠失を有する変異株を扱う。細胞質から真空胞への標的経路におけるベシクル形成およびオートファジーに必要なタンパク質セリン/スレオニンタンパク質キナーゼのATG1コード。ATG1ヌル突然変異体は、異常に短い年代順寿命を有する表現型を有する。
この老化研究室では、ATG1ヌル変異体の異常に短い寿命特性を救助または抑制できる遺伝的要因を設計し、テストします。しかし、これは他の短命の遺伝的背景にも拡大することができます。このプロセスの最初のステップは、寿命を延ばすためにリンクされている遺伝子を同定することです。
私たちは、特に、時系列の寿命を延ばす遺伝子が過剰発現したときに焦点を当てるつもりです。これを行うために、酵母ゲノムデータベースからアクセス可能な一般に公開されているデータを使用します。私たちはここに上がるつもりです。
表現型で検索します。そして、途中で、私たちは時系列の寿命を選択できることがわかります。寿命を延ばす遺伝子を探すために、あなたが見ることができるのは、この特定の表現型にリンクされた遺伝子を持つ豊富なデータです。
今日、私たちはSIR2、それが過剰に表現されたときに延長時系列寿命にリンクされているヒストンリジンデアセチラーゼを研究します。まず、コード領域のDNA配列と、この遺伝子の両側に隣接する調節領域にアクセスします。400個の塩基対を上流と下流に持ち込み、すべての規制地域を確実に包含します。
このDNA配列を用いて、この遺伝子をプラスミドベクターにクローン化できるPCRプライマーを設計します。PCRを用いて遺伝子を増幅し、pRS315ベクターにクローン化します。これを行うために、HindIIIおよびSacII制限サイトを組み込んだ制限消化部位を含むプライマーを設計します。
ご覧のとおり、プラスミドには、ヒンドIIIとSacIIの両方の制限サイトが含まれているため、クローニングが容易になります。PCR プライマーは、増幅したい領域に対して約 21 または 22 個の配列を含む配列を含む設計を行う必要があります。配列に加えて、前方プライマーのHindIII、または逆プライマーのSacIIのいずれかの適切な制限部位にそれぞれ赤と紫で示されている5つのプライムエンドに追加し、さらに上流に制限酵素が結合し、より高い効率で制限消化部位を作成することを可能にするいくつかのヌクレオチドを追加します。
YPADなどの濃縮培地中でログ後段階に野生型酵母の5ミリリットル培養を一晩成長させる。真菌ゲノム分離に特化した市販キットを使用してゲノムDNAを収穫します。彼らは浸透する非常に剛性とタフな細胞壁を持っているので、キットは、酵母に特異的であることが重要です。
ジモリアーゼ処理は、細胞壁を消化するのに有効であり、ゲノム収率を大幅に増加させます。分光光度計を使用して、DNAの量と品質を決定します。クローニングに適したアンプリコンを製造するには、増幅プロセス中の変異を避けるために高忠実性PCRポリメラーゼを利用する必要がある。
市販されている多くの異なる忠実度 PCR キットがあります。反応の最適化を容易にするために、複数のバッファリングシステム、標準の高忠実度バッファ、および複雑なアンプリコンの高いGC含有量に最適化されたシステムを提供するキットを選択することをお勧めします。私たちはゲノムDNAの200ナノグラムを追加するつもりです。
バッファーの 5 マイクロリットルを追加します。私たちは、フォワードとリバースプライマーの2 1/2マイクロリットルを追加するつもりです。ポリメラーゼ1マイクロリットル、Dの2マイクロリットルを追加します。
そして最後に、滅菌蒸留水で50マイクロリットルに対する反応全体をQSに行きます。使用している酵素に固有のプロトコルと、この実験で設計したプライマーに応じて反応を実行します。PCR反応をクリーンアップし、濃縮します。
選択培地で一晩大腸菌の5ミリリットル培養を成長させます.ペレットは遠心分離により培養し、上清を捨てる。提供されたカオトロピックバッファー内の細胞を再中断し、5 分間ライスします。
反応を中和し、反転によって2つを5〜6回混ぜます。サンプルを最大速度で10分間遠心分離します。上清をシリカカラムに移し、用意されたバッファーで洗浄します。
流れを捨て、その間に30秒の遠心を入れて他の適切なバッファーで洗浄を繰り返し、それぞれ後に流れを捨てます。最後に、遠心分離機は残留エタノールを除去し、プラスミドを20マイクロリットル溶出バッファーに溶け出し、分光光度計で量と品質を決定します。今度は、ベクトルとインサートの制限消化を設定する時間です。
625ナノグラムのDNA、ベクターまたはインサート、CutSmartバッファーの5マイクロリットル、SacIIの1マイクロリットル、HindIIIの1マイクロリットル、およびQSを水との反応に加え、最終的な反応量を50マイクロリットルにします。制限消化器を37°Cで3時間インキュベートし、続いて80°Cで20分間酵素を加熱して活性化させます。この時点で、次のステップに進む前に、消化器を4度で保存できます。
次に、消化されたゲノムフラグメントと、完成したばかりのベクターを使用して15マイクロリットルのライゲーションを設定します。まず、6マイクロリットルの水を加えます。我々は、我々の消化されたベクトルの2マイクロリットルを追加するつもりです。
これは私たちのpRS315プラスミドです。私たちは、私たちのインサー2遺伝子の4マイクロリットルを追加するつもりです。私たちはリガーゼバッファの2マイクロリットルを追加するつもりです、ケース10Xバッファ。
そして最後に、リガーゼの1マイクロリットルを追加します。これを一晩16度でインキュベートし、摂氏80度で酵素を20分間熱死させるつもりです。私たちの正常に作成されたプラスミドをスクリーニングするために、私たちはそれを大腸菌に変換するつもりです。
私たちは、化学的に有能な細胞の50マイクロリットルを使用するつもりです。氷の上で解凍し、解凍するとすぐにライゲーション反応を追加し、内容全体を追加します。そこで、インサートで15マイクロリットルのライゲーションを追加し、15マイクロリットルの無挿入制御を別の反応に追加します。
追加したら、チューブを数回フリックして混ぜます。そして、私たちは氷の上でこれをインキュベートするつもりです。氷上での30分間のインキュベーションを完了した後、サンプルを42度の加熱ブロックに追加し、20秒間インキュベートしてヒートショックを受け、そこでそれらを取り出し、回収メディアを追加します。
ヒートショックの後、我々は回復期間を許可するつもりです。私たちはサンプルを採取し、450マイクロリットルのSOCメディアを追加します。我々は、プラスミドを拾うことを可能にし、アンピシリン耐性遺伝子が発現し始めるために、摂氏37度でこれらをインキュベートします。
これらのサンプルは37度で45分間回復します。そのインキュベーションの後、私たちは一連の希釈物、1〜10、および1〜100を設定し、LB / Ampメディアにこれらをプレートし、細胞が一晩で成長できるようにするつもりです。滅菌技術を使用してプレートを打ち上げします。
適切なプレートを取ります, 我々はそれに従ってラベル付けし、私たちの選択可能なマーカーが含まれています.私たちは、私たちの変換された大腸菌の150マイクロリットルを取ります。滅菌接種ループを使用して、プレート全体と全体に細胞を穏やかに広げるので、素敵な均等な分布を得ます。
すべての希釈液のめっきを終えたら、これらのプレートを摂氏37度で一晩インキュベートして、何が成長するかを確認します。約1日後、私たちが作ろうとしていたプラスミドを含むコロニーが成長しているのを見るべきです。彼らはこのようなものに見えるはずです。
滅菌技術を使用して、前に概説された手順に従って5ミリリットルLBプラスアンピシリンにあなたの変換から成長した潜在的な形質転換体を接種する。プラスミドをあらゆる潜在的な変換剤から分離し、前述のように制限消化を実行します。アガロースゲル上で反応生成物を実行し、潜在的な形質転換体を空のベクターと比較します。
さらに研究するために、適切なサイズの挿入物の切除につながる変換剤を保存します。プラスミドの作成に成功したので、ATG1ヌル酵母の背景に変換します。私たちは15ミルの細胞を取るつもりです、そして、私はすでにここでやったそれらをペレットするつもりです。
ペレット化した後、成長していたYPAD培地を取り除き、蒸留水で細胞を洗います。その後、細胞を取り、100ミリモル酢酸リチウムで再中断するつもりです。私たちは、その200マイクロリットルでそれらを再中断するつもりです。
上下に穏やかなピペットを使用して細胞ペレットを再懸濁します。このミックスを変換ごとに 50 マイクロリットルを使用して、実行する変換のそれぞれについて、セルを別々のマイクロフュージ チューブに分割します。変換のそれぞれに、50%PEGの240マイクロリットルを追加する必要があります。
PEGは非常に粘性、ピペットであり、非常に慎重に測定します。PEGの添加後および追加の各成分の後にピペットによって混合する。次に、酢酸大臼歯リチウム36マイクロリットル、5マイクロリットルのサケ精子DNA、または他のキャリアDNAを加え、5分間沸騰して氷の上に置き、最後に各変換のためにプラスミドの5マイクロリットルを加えます。
各チューブを完全に渦を混ぜ合わせます。摂氏30度でサンプルを45分間インキュベートします。42°10分間熱ショックを受け、滅菌水で細胞を一度洗い、最終的に200マイクロリットルの無菌水で再懸濁します。
SCマイナスロイプレートに酵母とプレート150マイクロリットルの形質転換株のそれぞれ1〜10〜100の希釈液を設定し、プラスミドを選択します。細胞を均一に均等に広げ、プレートを30度で反転してインキュベートする前に乾燥させ、48〜72時間成長させます。遺伝子のクローンを正常にクローン化してテストしたら、生物の時系列寿命への影響をテストします。
我々は、時間の関数として残っている実行可能なコロニー形成ユニットの数を監視し、酵母を成長させます。SCからロイシンを差し引いた液体培地で酵母を摂氏30度で最初に72時間成長させます。血球計を使用して、500個の細胞をプレートするために必要な希釈を決定します。
滅菌技術を使用して、細胞をSCマイナスleuプレートにプレートし、摂氏30度で3日間逆に乾燥させてインキュベートできるようにし、その時点で成長し、コロニーの成長をスコアリングし、その時点を記録することができます。プレートを作った後、振ることなく摂氏30度で酵母をインキュベートし続けます。当初は、毎週の間隔でめっきを繰り返し、予備的なデータが老化表現型の抑制を示唆する場合は、より頻繁な時点を取ります。
生存率を決定するために、分析のために1日の1つのタイムポイントに正規化します。すべての間隔で同じ希釈液をプレートしてください。コロニーが成長しなくなるまで、このプロセスを続行します。
Excel スプレッドシートに情報を入力すると便利です。これにより、実験の終了時に各菌株の生存率をすばやく判断できます。
