Le vieillissement se caractérise par la détérioration dépendante du temps de plusieurs processus cellulaires qui, en fin de compte, augmente la probabilité de mort de l’organisme. Au sein d’une population, ce processus est variable et un certain nombre de facteurs génétiques et environnementaux peuvent l’affecter. L’une des variables les mieux étudiées et comprises est le rôle de l’alimentation sur la durée de vie.
La restriction alimentaire est une intervention qui, en fin de compte, retarde l’apparition des changements associés au vieillissement et au vieillissement. Cela augmente la durée de vie et la durée de vie d’un organisme, ou la durée de vie normale et saine d’un organisme. Notre compréhension actuelle a mené à l’identification d’un ensemble distinct de changements cellulaires qui ont été appelés les caractéristiques du vieillissement, telles que l’accumulation des mutations, la dysrégulation des télomères, une perte de l’homéostasie de protéine, des problèmes de respiration, et des espèces réactives d’oxygène, entre autres.
Maintenant, une grande partie de cette compréhension provient d’études qui utilisent de nombreux organismes modèles différents. Il y a eu beaucoup d’écrans génétiques qui ont identifié des gènes qui raccourcissent et prolongent la durée de vie. Et ceux-ci incluent des études dans la levure naissante Saccharomyces cerevisiae, qui est au centre de cette méthodologie, ainsi que des études dans des organismes multicellulaires plus complexes, comme C.elegans et le système murin.
Parmi ceux-ci cependant, la levure naissante est particulièrement agréable aux études de vieillissement en raison de sa courte durée de vie naturelle et un certain nombre d’approches génétiques qui peuvent démêler les relations génétiques complexes, ce qui en fait un excellent système pour la dissection fonctionnelle de la génétique du vieillissement. La levure peut être utilisée pour étudier plusieurs aspects différents du vieillissement. Et nous nous concentrerons sur la durée de vie chronologique, qui est la durée pendant laquelle une cellule peut survivre.
L’objectif de ce travail est de présenter une approche génétique simple pour effectuer un écran suppresseur de sur-expression. Nous utiliserons un fond génétique qui se traduit par une durée de vie chronologique anormalement raccourcie. Et nous utiliserons une approche ciblée pour identifier les gènes qui peuvent sauver ou supprimer le phénotype raccourci de la durée de vie, en essayant d’identifier les gènes qui restaurent une durée de vie normale.
Le premier fond génétique est une souche autophagy-déficiente de levure. L’autophagie, qui se traduit vaguement par l’auto-alimentation, est un système de dégradation intracellulaire pour fournir des produits cytosoliques, tels que des protéines et des organites, au lysosome. Cela aide à maintenir l’homéostasie cellulaire en éliminant les protéines endommagées, ainsi que ceux qui ont survécu à leur vie.
Nous travaillerons avec une souche mutante qui a une suppression du gène ATG1. Codes ATG1 pour une kinase protéine serine/threonine-protéine qui est nécessaire pour la formation de vésicules et l’autophagie dans la voie de ciblage cytoplasme-vacuole. Le mutant nul ATG1 a un phénotype d’avoir une durée de vie chronologique anormalement courte.
Dans ce laboratoire vieillissant, nous concevons et testerons des facteurs génétiques qui peuvent sauver, ou supprimer, la durée de vie anormalement raccourcie caractéristique du mutant nul ATG1. Cependant, ceci peut être étendu à d’autres milieux génétiques de courte durée aussi bien. La première étape de ce processus consiste à identifier un gène lié à l’allongement de la durée de vie.
Nous allons nous concentrer spécifiquement sur les gènes qui prolongent la durée de vie chronologique lorsqu’ils sont sur-exprimés. Pour ce faire, nous allons utiliser les données accessibles au public qui sont accessibles à partir de la base de données sur le génome de la levure. On va monter ici.
Recherche par phénotype. Et à mi-chemin, nous verrons que nous pouvons sélectionner la durée de vie chronologique. Pour rechercher des gènes qui augmentent la durée de vie, ce que vous pouvez voir est la richesse des données disponibles qui a des gènes liés à ce phénotype particulier.
Aujourd’hui, nous étudierons SIR2, une lysine deacetylase histone qui est liée à une durée de vie chronologique prolongée lorsqu’elle est sur-exprimée. La première chose que nous ferons est d’accéder à la séquence d’ADN pour la région codant, ainsi que les régions réglementaires qui flanquent de chaque côté de ce gène. Nous prendons 400 paires de base en amont et en aval pour nous assurer que nous englobons toutes les régions réglementaires.
Nous utiliserons cette séquence d’ADN pour concevoir des amorces PCR qui nous permettront de cloner ce gène dans notre vecteur plasmide. Nous utiliserons pcr pour amplifier notre gène et le cloner dans le vecteur pRS315. Pour ce faire, nous concevons des amorces qui contiennent des sites de digestion de restriction qui intègrent des sites de restriction HindIII et SacII.
Comme vous pouvez le voir, le plasmide contient à la fois des sites de restriction, HindIII et SacII, qui faciliteront notre clonage. Vous devez concevoir vos amorces PCR pour contenir environ 21 ou 22 nucléotides de séquence complémentaires à la région que vous souhaitez amplifier. En plus de la séquence, vous ajouterez sur les cinq extrémités principales d’entre eux le site de restriction approprié, soit HindIII sur l’amorce avant, ou SacII sur l’amorce inverse, montré ici en rouge et violet respectivement, et plus en amont de cela, ajouter plusieurs nucléotides qui permettront à l’enzyme de restriction de lier et de créer le site de digestion de restriction à une efficacité plus élevée.
Cultiver une culture de cinq millilitres de la levure de type sauvage du jour au lendemain à la phase post-journal dans les médias enrichis, tels que le YPAD. Récoltez l’ADN génomique à l’aide d’un kit disponible dans le commerce qui est spécifique à l’isolement génomique fongique. Il est important que le kit est spécifique pour la levure, car ils ont une paroi cellulaire très rigide et dure à pénétrer.
Le traitement à la zymolyase est efficace pour digérer la paroi cellulaire et augmente considérablement le rendement génomique. Utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la quantité et la qualité de l’ADN. Pour produire un amplicon adapté au clonage, il est nécessaire d’utiliser une polymése PCR haute fidélité pour éviter les mutations pendant le processus d’amplification.
Il existe de nombreux kits PCR haute fidélité qui sont disponibles dans le commerce. Pour faciliter l’optimisation de la réaction, nous vous recommandons de choisir un kit qui fournit plusieurs systèmes de tampon, un tampon haute fidélité standard, et un optimisé pour un contenu GC élevé dans des amplicons complexes. Nous allons ajouter 200 nanogrammes de notre ADN génomique.
Nous allons ajouter cinq microlitres de notre tampon. Nous allons ajouter 2 1/2 microlitres de notre avant et nos amorces inversées. Nous allons ajouter un microlitre de notre polyméthère, deux microlitres de PNT D.
Et enfin, nous allons à QS toute la réaction à 50 microlitres avec de l’eau distillée stérile. Nous allons exécuter la réaction selon le protocole spécifique pour l’enzyme que nous utilisons, ainsi que pour les amorces que nous avons conçu dans cette expérience. Nettoyez et concentrez la réaction pcr.
Cultiver une culture de cinq millilitres d’E.coli pendant la nuit dans les médias sélectifs. Pelleter la culture par centrifugation et jeter le supernatant. Resuspendez et lysez les cellules dans le tampon chaotropique fourni pendant cinq minutes.
Neutraliser la réaction et mélanger les deux par inversion cinq ou six fois. Centrifugez votre échantillon pendant 10 minutes à vitesse maximale. Transférer le supernatant et dans une colonne de silice et laver avec le tampon fourni.
Jetez le flux à travers et répétez le lavage avec les autres tampons appropriés, avec centrifugations de 30 secondes entre les deux, jetant votre flux à travers après chacun. À la fin, centrifugeuse pendant deux minutes de plus pour éliminer tout éthanol résiduel et elute votre plasmide dans 20 microlitres tampon d’élitution et de déterminer la quantité et la qualité par spectrophotomètre. Maintenant, il est temps de mettre en place une digestion de restriction du vecteur et l’insert.
Ajouter 625 nanogrammes d’ADN, soit le vecteur ou l’insert, cinq microlitres de tampon CutSmart, un microlitre de SacII, un microlitre de HindIII, et QS la réaction avec de l’eau pour apporter le volume de réaction final à 50 microlitres. Incuber les digestes de restriction à 37 centigrades pendant trois heures, suivi de 80 centigrades pendant 20 minutes pour chauffer et activer les enzymes. À ce stade, les digestes peuvent être stockés à quatre degrés avant de passer à l’étape suivante.
Ensuite, nous allons mettre en place une ligature de 15 microlitres en utilisant notre fragment génomique digéré, ainsi que le vecteur que nous venons de terminer. Nous allons commencer par ajouter six microlitres d’eau. Nous allons ajouter deux microlitres de notre vecteur digéré.
C’est notre plasmide pRS315. Nous allons ajouter quatre microlitres de notre insert, le gène SIR2. Nous allons ajouter deux microlitres de notre tampon ligase, cas le tampon 10X.
Et enfin, nous allons ajouter un microlitre de la ligase. On va couver ça à 16 degrés pendant la nuit, et ensuite chauffer tuer l’enzyme à 80 degrés centigrades pendant 20 minutes. Pour dépister notre plasmide créé avec succès, nous allons le transformer en E.coli.
Nous allons utiliser 50 microlitres de cellules chimiquement compétentes. Nous allons les décongeler sur la glace, et dès qu’ils dégelent, nous allons ajouter notre réaction de ligature, nous allons ajouter tout le contenu de celui-ci. Donc, nous allons ajouter 15 microlitres de la ligature avec l’insert, et nous allons ajouter 15 microlitres de notre contrôle sans insertion ainsi à une réaction distincte.
Une fois qu’il a été ajouté, feuilletez le tube à quelques reprises afin de le mélanger. Et on va l’incuber sur la glace. Après avoir terminé l’incubation de 30 minutes sur la glace, nous allons ajouter nos échantillons dans un bloc chauffant de 42 degrés où nous allons incuber et choc thermique pendant 20 secondes, quel point nous allons les sortir, et nous allons ajouter des supports de récupération.
Après le choc thermique, nous allons permettre une période de récupération. Nous allons prélever nos échantillons et ajouter 450 microlitres de médias SOC. Nous les incuberons à 37 degrés centigrades pour permettre aux plasmides d’être ramassés et pour permettre au gène de résistance à l’ampicilline de commencer à s’exprimer.
Nous allons permettre à ces échantillons de récupérer à 37 degrés pendant 45 minutes. Après cette incubation, nous avons mis en place une série de dilutions, une à 10, et une à 100, et nous allons les plaquer sur les médias LB / Amp et permettre aux cellules de grandir pendant la nuit. Nous les plaquerons à l’aide d’une technique stérile.
Nous prendrons la plaque appropriée, que nous avons étiquetée en conséquence et contient notre marqueur sélectionnable. Nous prendons 150 microlitres de notre E.coli transformé. À l’aide d’une boucle stérile d’inoculation, nous allons ensuite étendre doucement les cellules dans l’ensemble de la plaque afin que nous obtenons une belle distribution uniforme.
Une fois que nous aurons fini de placage de toutes nos dilutions, nous incuberons ces plaques pendant la nuit à 37 degrés centigrades pour voir ce qui pousse. Après environ une journée, nous devrions voir grandir des colonies qui, espérons-le, contiennent le plasmide que nous tentions de créer. Ils devraient ressembler à ça.
En utilisant la technique stérile, inoculer les transformateurs potentiels qui ont grandi à partir de votre transformation en cinq millilitres LB plus ampicilline suivant la procédure précédemment décrite. Isoler les plasmides de tout transformateur potentiel et exécuter une digestion de restriction comme décrit précédemment. Exécutez les produits de réaction sur un gel agarose, en comparant les transformateurs potentiels au vecteur vide.
Enregistrez tous les transformateurs qui entraînent l’excision d’un insert de bonne taille pour une étude plus approfondie. Après avoir créé avec succès notre plasmide, nous allons le transformer en fond de levure nulle ATG1. On va prendre 15 millions de cellules et on va les pelleter, ce que j’ai déjà fait ici.
Une fois qu’ils ont granulé, enlever les médias YPAD qu’ils cultivaient et laver les cellules avec de l’eau distillée. Après ça, on va prendre les cellules et on va les résusquer en acétate de lithium de 100 millimlaires. Nous allons les résuser dans 200 microlitres de cela.
Resuspendez la pastille de cellules en pipetting doux de haut en bas. Divisez les cellules en tubes de microfuge séparés pour chacune des transformations que vous effectuerez, à l’aide de 50 microlitres de ce mélange par transformation. À chacune des transformations, vous devrez ajouter 240 microlitres de 50%PEG.
PEG est très visqueux, pipette et mesurer très soigneusement. Mélanger par pipetting après l’ajout de la PEG et après chacun des composants supplémentaires. Ajoutez ensuite 36 microlitres d’un acétate de lithium molaire, cinq microlitres d’ADN de sperme de saumon, ou tout autre ADN porteur, qui a été bouilli pendant cinq minutes et placé sur la glace, et enfin cinq microlitres du plasmide pour chaque transformation que vous effectuerez.
Vortex chaque tube à fond mélanger. Incubez vos échantillons à 30 degrés centigrades pendant 45 minutes. La chaleur les choque à 42 centigrades pendant 10 minutes, puis lave les cellules une fois dans l’eau stérile, les réutilisant finalement dans 200 microlitres d’eau stérile.
Mettre en place une à 10 et une à 100 dilutions de chacune des souches transformées de levure et plaque 150 microlitres sur SC moins les plaques leu à sélectionner pour les plasmides. Étendre les cellules uniformément et uniformément, et laisser sécher les plaques avant de les inverser et de les incuber à 30 degrés centigrades, leur permettant de croître pendant 48 à 72 heures. Une fois que nous aurons cloné notre gène avec succès pour le tester, nous testerons l’effet sur la durée de vie chronologique de l’organisme.
Nous cultiverons la levure, en surveillant le nombre d’unités viables formant des colonies qui restent en fonction du temps. Faire pousser la levure d’abord pendant 72 heures dans SC moins leucine liquide média avec secouant à 30 degrés centigrades. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminez la dilution nécessaire pour vous permettre de plaquer 500 cellules.
En utilisant la technique stérile, plaquez les cellules sur une plaque SC moins leu, ce qui lui permet de sécher et d’incuber inversé pendant trois jours à 30 degrés centigrades, à quel point ils grandiront et vous pouvez marquer la croissance de la colonie et enregistrer ce point de temps. Après avoir fait la plaque, continuer à couver votre levure à 30 degrés centigrades sans trembler. Initialement, nous répétons le placage à intervalles hebdomadaires, en prenant des points de temps plus fréquents si nos données préliminaires suggèrent une suppression du phénotype vieillissant.
Afin de déterminer la viabilité en pourcentage, nous normalisons au jour un point de temps pour l’analyse. Assurez-vous de plaquer la même dilution à chaque intervalle. Continuez ce processus jusqu’à ce que vous ne voyiez plus de colonies grandir.
Il est utile d’entrer vos informations dans une feuille de calcul Excel. Cela vous permettra de déterminer rapidement la viabilité de chaque souche à la fin de l’expérience.
