L'invecchiamento è caratterizzato dal deterioramento dipendente dal tempo di più processi cellulari che alla fine aumenta la probabilità di morte dell'organismo. All'interno di una popolazione, questo processo è variabile e una serie di fattori genetici e ambientali possono influenzarlo. Una delle variabili meglio studiate e comprese è il ruolo della dieta sulla durata della vita.
La restrizione dietetica è un intervento che alla fine ritarda l'inizio dei cambiamenti associati all'invecchiamento e all'invecchiamento. Ciò aumenta la durata della vita e della durata della salute di un organismo, o il periodo di tempo in cui un organismo ha una vita normale e sana. La nostra attuale comprensione ha portato all'identificazione di un insieme distinto di cambiamenti cellulari che sono stati definiti i tratti distintivi dell'invecchiamento, come l'accumulo di mutazioni, la disregolazione dei telomeri, una perdita di omeostasi proteica, problemi respiratori e specie reattive dell'ossigeno, tra gli altri.
Gran parte di questa comprensione proviene da studi che usano molti organismi modello diversi. Ci sono stati molti schermi genetici che hanno identificato geni che accorciano e prolungano la durata della vita. E questi includono studi sul lievito in erba Saccharomyces cerevisiae, che è al centro di questa metodologia, così come studi su organismi multicellulari più complessi, come c.elegans e il sistema murino.
Di questi, tuttavia, il lievito in erba è particolarmente suscettibile agli studi di invecchiamento a causa della sua breve durata naturale della vita e di una serie di approcci genetici che possono svelare le complesse relazioni genetiche, rendendolo un eccellente sistema per la dissezione funzionale della genetica dell'invecchiamento. Il lievito può essere utilizzato per studiare diversi aspetti dell'invecchiamento. E ci concentreremo sulla durata cronologica della vita, che è la durata in cui una cellula può sopravvivere.
L'obiettivo di questo lavoro è quello di presentare un approccio genetico semplice per eseguire uno schermo soppressore di sovraespressive. Utilizzeremo un background genetico che si traduce in una durata cronologica anomalamente ridotta. E utilizzeremo un approccio mirato per identificare i geni che possono salvare o sopprimere il fenotipo della durata della vita ridotta, cercando di identificare i geni che ripristinano una durata normale della vita.
Il primo background genetico è un ceppo di lievito carente di autofagia. L'autofagia, che si traduce liberamente come auto-mangiante, è un sistema di degradazione intracellulare per fornire prodotti citosolici, come proteine e organelli, al lisosoma. Questo aiuta a mantenere l'omeostasi cellulare eliminando le proteine danneggiate, così come quelle che sono sopravvissute alla loro vita.
Lavoraremo con un ceppo mutante che ha una cancellazione del gene ATG1. Codici ATG1 per una proteina serina/treonina-protein chinasi necessaria per la formazione di vescicole e autofagia nella via di targeting citoplasma-vacuolo. Il mutante nullo ATG1 ha un fenotipo di avere una durata cronologica anormalmente breve.
In questo laboratorio di invecchiamento, progetteremo e testeremo i fattori genetici che possono salvare, o sopprimere, la durata di vita anormalmente ridotta caratteristica del mutante nullo ATG1. Tuttavia, questo può essere esteso anche ad altri background genetici di breve durata. Il primo passo in questo processo è identificare un gene collegato all'allungamento della durata della vita.
Ci concentreremo specificamente sui geni che estendono la durata cronologica della vita quando sono sovra-espressi. Per fare questo, useremo i dati disponibili al pubblico accessibili dal database del genoma del lievito. Andremo quassù.
Cerca per fenotipo. E verso la metà verso il basso, vedremo che possiamo selezionare la durata cronologica della vita. Per cercare geni che aumentino la durata della vita, quello che potete vedere è la ricchezza di dati disponibili che ha geni collegati a questo particolare fenotipo.
Oggi studieremo SIR2, una desacetilasi istonina che è legata a una lunga durata cronologica quando è sovraescriva. La prima cosa che faremo è accedere alla sequenza del DNA per la regione codificante, così come le regioni normative che fiancheggiano entrambi i lati di questo gene. Prenderemo 400 coppie di basi a monte e a valle per essere sicuri di comprendere tutte le regioni normative.
Useremo questa sequenza di DNA per progettare primer PCR che ci permetteranno di clonare questo gene nel nostro vettore plasmide. Useremo la PCR per amplificare il nostro gene e clonarlo nel vettore pRS315. Per fare ciò, proieleremo primer che contengono siti di digestione delle restrizioni che incorporano siti di restrizione HindIII e SacII.
Come puoi vedere, il plasmide contiene entrambi i siti di restrizione, HindIII e SacII, che faciliteranno la nostra clonazione. È necessario progettare i primer PCR in modo da contenere circa 21 o 22 nucleotidi di sequenza in omaggio alla regione che si desidera amplificare. Oltre alla sequenza, si aggiungerà alle cinque estremità prime di esse il sito di restrizione appropriato, o HindIII sul primer in avanti, o SacII sul primer inverso, mostrato qui rispettivamente in rosso e viola, e più a monte di ciò, aggiungere diversi nucleotidi che permetteranno all'enzima di restrizione di legare e creare il sito di digestione di restrizione a una maggiore efficienza.
Coltivare una coltura di cinque millilitri del lievito di tipo selvatico durante la notte fino alla fase post-log in supporti arricchiti, come l'YPAD. Raccogli il DNA genomico utilizzando un kit disponibile in commercio specifico per l'isolamento genomico fungino. È importante che il kit sia specifico per il lievito, in quanto hanno una parete cellulare molto rigida e dura da penetrare.
Il trattamento con zymolyase è efficace nel digerire la parete cellulare e aumenta notevolmente la resa genomica. Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la quantità e la qualità del DNA. Per produrre un amplicon adatto alla clonazione, è necessario utilizzare una polimerasi PCR ad alta fedeltà per evitare mutazioni durante il processo di amplificazione.
Ci sono molti diversi kit PCR ad alta fedeltà che sono disponibili in commercio. Per facilitare l'ottimizzazione della reazione, si consiglia di scegliere un kit che fornisca più sistemi di buffering, uno che sia un buffer standard ad alta fedeltà e uno ottimizzato per alti contenuti GC in ampliconi complessi. Aggiungeremo 200 nanogrammi del nostro DNA genomico.
Aggiungeremo cinque microlitri del nostro buffer. Aggiungeremo 2 microlitri 1/2 del nostro primer in avanti e inverso. Aggiungeremo un microlitro della nostra polimerasi, due microlitri di D NTP.
E infine, stiamo andando a QS l'intera reazione a 50 microlitri con acqua distillata sterile. Eseguiremo la reazione secondo il protocollo specifico per l'enzima che stiamo usando, così come per i primer che abbiamo progettato in questo esperimento. Pulire e concentrare la reazione PCR.
Coltiva una cultura di cinque millilitri di E.coli durante la notte in mezzi selettivi. Pellet la coltura per centrifugazione e scartare il supernatante. Resuspend e lyse le cellule nel tampone chaotropico fornito per cinque minuti.
Neutralizzare la reazione e mescolare i due per inversione cinque o sei volte. Centrifuga il campione per 10 minuti alla massima velocità. Trasferire il supernatante e su una colonna di silice e lavare con il tampone fornito.
Scartare il flusso e ripetere il lavaggio con gli altri buffer appropriati, con centrifugazioni di 30 secondi nel mezzo, scartando il flusso dopo ciascuno. Alla fine, centrifugare per altri due minuti per rimuovere l'etanolo residuo ed eludere il plasmide in un tampone di eluizione di 20 microlitri e determinare la quantità e la qualità tramite spettrofotometro. Ora è il momento di impostare una digestione di restrizione del vettore e dell'inserto.
Aggiungere 625 nanogrammi di DNA, sia il vettore che l'inserto, cinque microlitri di tampone CutSmart, un microlitro di SacII, un microlitro di HindIII e QS la reazione con acqua per portare il volume di reazione finale a 50 microlitri. Incubare i digestori di restrizione a 37 centigradi per tre ore, seguiti da 80 centigradi per 20 minuti per riscaldare e attivare gli enzimi. A questo punto, i digest possono essere conservati a quattro gradi prima di procedere al passaggio successivo.
Successivamente, stiamo per impostare una legatura di 15 microliter usando il nostro frammento genomico digerito, così come il vettore che abbiamo appena completato. Inizieremo aggiungendo sei microlitri d'acqua. Aggiungeremo due microlitri del nostro vettore digerito.
Questo è il nostro pRS315 plasmide. Aggiungeremo quattro microlitri del nostro inserto, il gene SIR2. Aggiungeremo due microlitri del nostro buffer di ligasi, nel caso del buffer 10X.
E infine, aggiungeremo un microlitro della ligasi. Lo incubamo a 16 gradi durante la notte, e poi il calore ucciderà l'enzima a 80 gradi centigradi per 20 minuti. Per migliorare il nostro plasmide creato con successo, lo trasformeremo in E.coli.
Useremo 50 microlitri di cellule chimicamente competenti. Li scongeleremo sul ghiaccio, e non appena si scongeleranno, aggiungeremo la nostra reazione di legatura, ne aggiungeremo l'intero contenuto. Quindi aggiungeremo 15 microlitri della legatura con l'inserto, e aggiungeremo anche 15 microlitri del nostro controllo senza inserto a una reazione separata.
Una volta aggiunto, scorrere il tubo alcune volte per mescolarlo. E lo incubamo sul ghiaccio. Dopo aver completato l'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio, aggiungeremo i nostri campioni in un blocco riscaldante a 42 gradi dove incubamo e shock termico per 20 secondi, il punto in cui li toglieremo, e aggiungeremo supporti di recupero.
Dopo lo shock termico, consentiremo un periodo di recupero. Prenderemo i nostri campioni e aggiungeremo 450 microlitri di supporti SOC. Li incubamo a 37 gradi centigradi per consentire il raccolto dei plasmidi e permettere che il gene della resistenza all'ampicillina inizi ad essere espresso.
Consentiremo a questi campioni di recuperare a 37 gradi per 45 minuti. Dopo quell'incubazione, abbiamo impostato una serie di diluizioni, da una a 10, e da una a 100, e le piastreremo su supporti LB/Amp e permetteremo alle cellule di crescere durante la notte. Li piastreremo usando una tecnica sterile.
Prenderemo la piastra appropriata, che abbiamo etichettato di conseguenza e contiene il nostro marcatore selezionabile. Prenderemo 150 microlitri del nostro E.coli trasformato. Utilizzando un ciclo inoculato sterile, diffonderemo delicatamente le cellule in tutta la piastra e su tutta la piastra in modo da ottenere una bella distribuzione uniforme.
Una volta che avremo finito di placcare tutte le nostre diluizioni, incubamo queste piastre durante la notte a 37 gradi centigradi per vedere cosa cresce. Dopo circa un giorno, dovremmo vedere crescere colonie che si spera contengano il plasmide che stavamo cercando di creare. Dovrebbero assomigliare a questo.
Utilizzando una tecnica sterile, inoculare potenziali trasformatori che sono cresciuti dalla trasformazione in cinque millilitri LB più ampicillina seguendo la procedura precedentemente delineata. Isolare i plasmidi da ogni potenziale trasformatore ed eseguire una digestione di restrizione come descritto in precedenza. Eseguire i prodotti di reazione su un gel di agarosio, confrontando i potenziali trasformatori con il vettore vuoto.
Salvare eventuali trasformatori che si traducono in escissione di un inserto di dimensioni corretta per ulteriori studi. Dopo aver creato con successo il nostro plasmide, lo trasformeremo nello sfondo del lievito nullo ATG1. Prenderemo 15 milioni di cellule e le palttiamo, cosa che ho già fatto qui.
Dopo aver pellettato, rimuovere i supporti YPAD in cui stavano crescendo e lavare le cellule con acqua distillata. Dopo di che, prenderemo le cellule e le rimorneremo in acetato di litio da 100 millimolare. Li rimorneremo in 200 microlitri.
Resuspend il pellet di cella con pipettazione delicata su e giù. Dividi le celle in tubi di microfugo separati per ciascuna delle trasformazioni che eseguirai, utilizzando 50 microlitri di questo mix per trasformazione. A ciascuna delle trasformazioni, sarà necessario aggiungere 240 microlitri del 50%PEG.
PEG è molto viscoso, pipetta e misurare con molta attenzione. Mescolare con pipettazione dopo l'aggiunta del PEG e dopo ciascuno dei componenti aggiuntivi. Quindi aggiungi 36 microlitri di un acetato di litio molare, cinque microlitri di DNA dello sperma di salmone o altro DNA portatore, che è stato bollito per cinque minuti e posto sul ghiaccio, e infine cinque microlitri del plasmide per ogni trasformazione che eseguirai.
Vortice ogni tubo accuratamente da mescolare. Incubare i campioni a 30 gradi centigradi per 45 minuti. Scaldarli a 42 centigradi per 10 minuti, quindi lavare le cellule una volta in acqua sterile, rimescolandole infine in 200 microlitri di acqua sterile.
Impostare da uno a 10 e da una a 100 diluizioni di ciascuno dei ceppi trasformati di lievito e piastra 150 microlitri su piastre SC meno leu da selezionare per i plasmidi. Stendere le cellule in modo uniforme e uniforme e lasciare asciugare le piastre prima di invertirle e incubarle a 30 gradi centigradi, permettendo loro di crescere per 48-72 ore. Una volta clonato con successo il nostro gene da testare, testeremo l'effetto sulla durata cronologica dell'organismo.
Cresceremo il lievito, monitorando il numero di unità di formazione di colonie vitali che rimangono in funzione del tempo. Far crescere il lievito per primo per 72 ore in SC meno i mezzi liquidi di leucina con scuotimento a 30 gradi centigradi. Utilizzando un emocitometro, determinare la diluizione necessaria per consentire di placcare 500 cellule.
Usando una tecnica sterile, placcare le cellule su una piastra SC meno leu, permettendogli di asciugarsi e incubare invertita per tre giorni a 30 gradi centigradi, a quel punto cresceranno e puoi segnare la crescita della colonia e registrare quel punto di tempo. Dopo aver fatto il piatto, continuare a incubare il lievito a 30 gradi centigradi senza tremare. Inizialmente, ripetiamo la placcatura a intervalli settimanali, prendendo punti di tempo più frequenti se i nostri dati preliminari suggeriscono una soppressione del fenotipo di invecchiamento.
Per determinare la percentuale di vitalità, normalizziamo fino al giorno un punto di tempo per l'analisi. Assicurati di placcare la stessa diluizione ad ogni intervallo. Continua con questo processo fino a quando non vedi più crescere colonie.
È utile immettere le informazioni in un foglio di calcolo di Excel. Ciò ti consentirà di determinare rapidamente la vitalità di ogni ceppo al termine dell'esperimento.
