O envelhecimento é caracterizado pela deterioração temporal de múltiplos processos celulares que, em última análise, aumenta a probabilidade de morte organismoal. Dentro de uma população, esse processo é variável e uma série de fatores genéticos e ambientais podem afetá-lo. Uma das variáveis mais bem estudadas e compreendidas é o papel da dieta na vida útil.
A restrição alimentar é uma intervenção que, em última análise, atrasa o início do envelhecimento e mudanças associadas ao envelhecimento. Isso aumenta a vida útil e a vida de um organismo, ou o tempo em que um organismo tem uma vida normal e saudável. Nosso entendimento atual levou à identificação de um conjunto distinto de mudanças celulares que foram denominadas as marcas do envelhecimento, como o acúmulo de mutações, a desregulação dos telômeros, a perda de homeostase proteica, problemas respiratórios e espécies reativas de oxigênio, entre outras.
Agora, grande parte desse entendimento vem de estudos que usam muitos organismos modelos diferentes. Houve muitas telas genéticas que identificaram genes que encurtam e prolongam a vida útil. E estes incluem estudos na levedura saccharomyces cerevisiae, que é o foco desta metodologia, bem como estudos em organismos multicelulares mais complexos, como C.elegans e o sistema murino.
Destes, porém, a levedura brotante é particularmente favorável aos estudos de envelhecimento devido à sua curta vida natural e uma série de abordagens genéticas que podem desvendar as complexas relações genéticas, tornando-se um excelente sistema de dissecção funcional da genética do envelhecimento. A levedura pode ser utilizada para estudar vários aspectos diferentes do envelhecimento. E vamos nos concentrar na vida cronológica, que é a duração que uma célula pode sobreviver.
O objetivo deste trabalho é apresentar uma abordagem genética simples para realizar uma tela supressora de expressão excessiva. Utilizaremos um fundo genético que resulta em uma vida cronológica anormalmente encurtada. E usaremos uma abordagem direcionada para identificar genes que podem resgatar ou suprimir o fenótipo de vida reduzido, tentando identificar genes que restauram uma vida útil normal.
O primeiro fundo genético é uma cepa de levedura deficiente em autofagia. A autofagia, que se traduz livremente como auto-comer, é um sistema de degradação intracelular para fornecer produtos citosóicos, como proteínas e organelas, ao lysosome. Isso ajuda a manter a homeostase celular eliminando proteínas danificadas, bem como aquelas que sobreviveram à sua vida.
Trabalharemos com uma cepa mutante que tem uma exclusão do gene ATG1. Códigos ATG1 para uma proteína serina/proteína de proteína quinase necessária para formação de vesículas e autofagia na via de mira citoplasma-para-vacuole. O mutante nulo ATG1 tem um fenótipo de ter uma vida cronológica anormalmente curta.
Neste laboratório de envelhecimento, vamos projetar e testar fatores genéticos que podem resgatar, ou suprimir, a vida anormalmente reduzida característica do mutante nulo ATG1. No entanto, isso pode ser expandido para outras origens genéticas de curta duração também. O primeiro passo nesse processo é identificar um gene que está ligado à extensão da vida útil.
Vamos nos concentrar especificamente nos genes que estendem a vida cronológica quando são super-expressos. Para isso, usaremos os dados disponíveis publicamente que estão acessíveis a partir do banco de dados do genoma da levedura. Vamos subir aqui.
Procure por fenótipo. E no meio do caminho, veremos que podemos selecionar a vida cronológica. Para procurar genes que aumentam a vida útil, o que você pode ver é a riqueza de dados disponíveis que tem genes ligados a esse fenótipo particular.
Hoje, estudaremos SIR2, uma deacetylase histone lysine que está ligada à vida útil cronológica prolongada quando estiver super expressa. A primeira coisa que faremos é acessar a sequência de DNA para a região de codificação, bem como as regiões regulatórias que flanqueiam ambos os lados deste gene. Levaremos 400 pares de bases rio acima e rio abaixo para ter certeza de que englobamos todas as regiões regulatórias.
Usaremos esta sequência de DNA para projetar primers PCR que nos permitirão clonar este gene em nosso vetor plasmídeo. Usaremos o PCR para amplificar nosso gene e cloná-lo no vetor pRS315. Para fazer isso, projetaremos primers que contenham locais de digestão de restrição que incorporam locais de restrição hindiII e SacII.
Como você pode ver, o plasmid contém ambos os locais de restrição, HindIII e SacII, que facilitarão nossa clonagem. Você deve projetar seus primers PCR para conter cerca de 21 ou 22 nucleotídeos de sequência complementar à região que você deseja amplificar. Além da sequência, você adicionará na extremidade cinco prime deles o local de restrição apropriado, ou hindiii no primer dianteiro, ou SacII no primer reverso, mostrado aqui em vermelho e roxo, respectivamente, e mais upstream disso, adicionar vários nucleotídeos que permitirão que a enzima de restrição se ligue e crie o local de digestão de restrição em uma maior eficiência.
Cresça uma cultura de cinco mililitros da levedura tipo selvagem durante a noite para a fase pós-log em mídia enriquecida, como YPAD. Colher DNA genômico usando um kit comercialmente disponível que é específico para isolamento genômico fúngico. É importante que o kit seja específico para levedura, pois eles têm uma parede celular muito rígida e resistente para penetrar.
O tratamento zymolyase é eficaz na digestão da parede celular e aumenta muito o rendimento genômico. Use um espectotómetro para determinar a quantidade e a qualidade do DNA. Para produzir um amplicon adequado para clonagem, é necessário utilizar uma polimerase PCR de alta fidelidade para evitar mutações durante o processo de amplificação.
Existem muitos kits PCR de alta fidelidade diferentes que estão disponíveis comercialmente. Para facilitar a otimização da reação, recomendamos escolher um kit que forneça vários sistemas de buffering, um que seja um buffer de alta fidelidade padrão e otimizado para alto teor de GC em amplicons complexos. Vamos adicionar 200 nanogramas do nosso DNA genômico.
Vamos adicionar cinco microliters do nosso buffer. Vamos adicionar 2 microlitros 1/2 da nossa frente e nossos primers invertidos. Vamos adicionar um microlitra da nossa polimerase, dois microliters de D NTPs.
E por último, vamos para qs toda a reação a 50 microliters com água destilada estéril. Executaremos a reação de acordo com o protocolo específico para a enzima que estamos usando, bem como para os primers que projetamos neste experimento. Limpar e concentrar a reação do PCR.
Cresça uma cultura de cinco mililitros de E.coli durante a noite em mídia seletiva. Pelotar a cultura por centrifugação e descartar o supernante. Resuspenda e lise as células no tampão chaotrótrópico fornecido por cinco minutos.
Neutralizar a reação e misturar os dois por inversão cinco ou seis vezes. Centrifugar sua amostra por 10 minutos em velocidade máxima. Transfira o supernatante e para uma coluna de sílica e lave com o tampão fornecido.
Descarte o fluxo através e repita a lavagem com os outros buffers apropriados, com centrífugas de 30 segundos no meio, descartando seu fluxo através de cada um. No final, centrífuga por mais dois minutos para remover qualquer etanol residual e elute seu plasmídeo em 20 tampão de eluição de microliters e determinar a quantidade e a qualidade por espectógrafo. Agora é hora de configurar uma digestão de restrição do vetor e da inserção.
Adicione 625 nanogramas de DNA, seja o vetor ou a inserção, cinco microliters de buffer CutSmart, um microliter de SacII, um microliter de HindIII, e QS a reação com água para trazer o volume de reação final para 50 microliters. Incubar os digestores de restrição a 37 centígrados por três horas, seguido de 80 centígrados por 20 minutos para aquecer e ativar as enzimas. Neste ponto, os digestos podem ser armazenados a quatro graus antes de prosseguir para o próximo passo.
Em seguida, vamos configurar uma ligação de 15 microliter usando nosso fragmento genômico digerido, bem como o vetor que acabamos de completar. Vamos começar adicionando seis microliters de água. Vamos adicionar dois microliters do nosso vetor digerido.
Este é o nosso plasmídeo pRS315. Vamos adicionar quatro microliters da nossa inserção, o gene SIR2. Vamos adicionar dois microliters do nosso buffer ligase, caso o buffer 10X.
E por último, vamos adicionar um microliter da ligase. Vamos incubar isso a 16 graus durante a noite, e então o calor mata a enzima a 80 graus centígrados por 20 minutos. Para testar nosso plasmídeo criado com sucesso, vamos transformá-lo em E.coli.
Vamos usar 50 microliters de células quimicamente competentes. Vamos descongelá-los no gelo, e assim que eles descongelarem, vamos adicionar nossa reação de ligadura, vamos adicionar todo o conteúdo dele. Então vamos adicionar 15 microliters da ligadura com a inserção, e vamos adicionar 15 microliters do nosso controle de não-inserção, bem como a uma reação separada.
Uma vez adicionado, aperte o tubo algumas vezes para misturá-lo. E vamos incubar isso no gelo. Depois de completar a incubação de 30 minutos no gelo, vamos adicionar nossas amostras em um bloco de aquecimento de 42 graus onde incubaremos e aqueceremos o choque por 20 segundos, que ponto vamos tirá-las, e adicionaremos mídia de recuperação.
Depois do choque térmico, vamos permitir um período de recuperação. Vamos colher nossas amostras e adicionar 450 microliters de mídia SOC. Vamos incubar estes a 37 graus centígrados para permitir que os plasmídeos sejam captados e para permitir que o gene de resistência à ampicilina comece a ser expresso.
Permitiremos que essas amostras se recuperem a 37 graus por 45 minutos. Depois dessa incubação, montamos uma série de diluições, de um a 10, e de 1 a 100, e vamos emplacar isso na mídia LB/Amp e permitir que as células cresçam da noite para o dia. Vamos emplacar usando técnica estéril.
Pegaremos a placa apropriada, que rotulamos de acordo e contém nosso marcador selecionável. Pegaremos 150 microliters do nosso E.coli transformado. Usando um laço inoculante estéril, vamos então espalhar suavemente as células por toda a placa para que tenhamos uma boa distribuição uniforme.
Assim que terminarmos de emplacar todas as nossas diluições, incubaremos essas placas durante a noite a 37 graus centígrados para ver o que cresce. Depois de cerca de um dia, devemos ver colônias crescendo que, esperançosamente, contêm o plasmídeo que estávamos tentando criar. Eles deveriam se parecer com isso.
Usando técnica estéril, inocula potenciais transformadores que cresceram a partir de sua transformação em cinco mililitros LB mais ampicillin seguindo o procedimento previamente delineado. Isole os plasmídeos de todos os potenciais transformadores e execute uma digestão de restrição como descrito anteriormente. Execute os produtos de reação em um gel de agarose, comparando os potenciais transformadores ao vetor vazio.
Salve todos os transformadores que resultem em excisão de uma inserção de tamanho adequado para um estudo mais aprofundado. Tendo criado com sucesso nosso plasmídeo, vamos transformá-lo no fundo de levedura nula ATG1. Vamos pegar 15 mils de células e vamos dodá-las, o que eu já fiz aqui.
Depois de serem pelotas, remova a mídia YPAD em que estavam crescendo e lave as células com água destilada. Depois disso, vamos pegar as células e resuspensá-las em 100 milialares de acetato de lítio. Vamos resuspensá-los em 200 microliters disso.
Resuspend a pelota da célula por tubos suaves para cima e para baixo. Divida as células em tubos de microfuge separados para cada uma das transformações que você realizará, usando 50 microliters dessa mistura por transformação. Para cada uma das transformações, você precisará adicionar 240 microliters de 50% PEG.
PEG é muito viscoso, pipeta e mede com muito cuidado. Misture por pipetação após a adição do PEG e depois de cada um dos componentes adicionais. Em seguida, adicione 36 microliters de um acetato de lítio molar, cinco microliters de DNA de espermatozoides de salmão, ou outro DNA portador, que foi fervido por cinco minutos e colocado no gelo, e finalmente cinco microliters do plasmídeo para cada transformação que você estará realizando.
Vórtice cada tubo completamente para misturar. Incubar suas amostras a 30 graus centígrados por 45 minutos. O calor os choca a 42 centígrados por 10 minutos, e depois lava as células uma vez em água estéril, finalmente reutilizando-as em 200 microliters de água estéril.
Configure de um a 10 e de uma a 100 diluições de cada uma das cepas transformadas de levedura e placa 150 microliters em SC menos placas de leu para selecionar para os plasmídeos. Espalhe as células uniformemente e uniformemente, e permita que as placas sequem antes de inverí-las e incuba-las a 30 graus centígrados, permitindo que elas cresçam por 48 a 72 horas. Assim que clonarmos nosso gene para testar, testaremos o efeito na vida cronológica do organismo.
Vamos cultivar a levedura, monitorando o número de unidades formadoras de colônias viáveis que permanecem em função do tempo. Cresça a levedura primeiro por 72 horas em SC menos a mídia líquida leucina com tremor a 30 graus centígrados. Usando um hemócito, determine a diluição necessária para permitir que você emplaque 500 células.
Usando técnica estéril, coloque as células em uma placa DE SC menos leu, permitindo que ela seque e incubar invertida por três dias a 30 graus centígrados, momento em que elas crescerão e você pode marcar o crescimento da colônia e registrar esse ponto de tempo. Depois de fazer a placa, continue incubando seu fermento a 30 graus centígrados sem tremer. Inicialmente, repetimos o revestimento em intervalos semanais, tomando pontos de tempo mais frequentes se nossos dados preliminares sugerirem uma supressão do fenótipo de envelhecimento.
Para determinar a viabilidade percentual, normalizamos até o dia um ponto de análise. Certifique-se de emplacar a mesma diluição em cada intervalo. Continue com esse processo até que você não veja mais nenhuma colônia crescendo.
É útil inserir suas informações em uma planilha do Excel. Isso permitirá determinar rapidamente a viabilidade de cada cepa na conclusão do experimento.
