ההזדקנות מאופיינת בהידרדרות תלוית זמן של תהליכים תאיים מרובים שבסופו של דבר מגדילים את ההסתברות למוות אורגניזמי. בתוך אוכלוסייה, תהליך זה משתנה ומספר גורמים גנטיים וסביבתיים יכולים להשפיע עליו. אחד המשתנים הנחקרים והמובנים ביותר הוא תפקידה של דיאטה על תוחלת החיים.
הגבלה תזונתית היא התערבות שבסופו של דבר מעכבת את תחילת השינויים הקשורים להזדקנות ולהזדקנות. זה מגביר את תוחלת החיים של האורגניזם ואת תוחלת הבריאות, או את משך הזמן שבו אורגניזם יש חיים נורמליים ובריאים. ההבנה הנוכחית שלנו הובילה לזיהוי של קבוצה ברורה של שינויים תאיים, כי כבר כינו את סימני ההיכר של ההזדקנות, כגון הצטברות של מוטציות, dysregulation של טלומרים, אובדן הונוסטזיס חלבון, בעיות נשימה, מיני חמצן תגובתי, בין היתר.
עכשיו הרבה הבנה זו מגיעה מחקרים המשתמשים באורגניזמים מודל שונים רבים. היו הרבה מסכים גנטיים שזיהו גנים שמקצרים ומאריכים את תוחלת החיים. ואלה כוללים מחקרים ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae, אשר הוא המוקד של מתודולוגיה זו, כמו גם מחקרים באורגניזמים רב תאיים מורכבים יותר, כמו C.elegans ואת מערכת מורין.
עם זאת, שמרי הניצנים נוחים במיוחד למחקרי הזדקנות בשל תוחלת החיים הטבעית הקצרה שלה ומספר גישות גנטיות שיכולות לפענח את היחסים הגנטיים המורכבים, מה שהופך אותו למערכת מצוינת עבור ניתוח תפקודי של הגנטיקה של ההזדקנות. שמרים יכולים להיות מנוצלים כדי ללמוד מספר היבטים שונים של הזדקנות. ואנחנו התמקדות בתוחלת חיים כרונולוגית, שהוא משך הזמן שתא יכול לשרוד.
מטרת עבודה זו היא להציג גישה גנטית פשוטה לביצוע מסך מדכא ביטוי יתר. אנו נשתמש ברקע גנטי שתוביל לקיצור חריג של תוחלת החיים הכרונולוגית. ואנחנו נשתמש בגישה ממוקדת כדי לזהות גנים שיכולים להציל או לדכא את פנוטיפ תוחלת החיים המקוצר, בניסיון לזהות גנים שמחזירים תוחלת חיים נורמלית.
הרקע הגנטי הראשון הוא זן אוטופגיה לקוי של שמרים. אוטופגיה, המתורגמת באופן רופף כאכילה עצמית, היא מערכת השפלה תאית המספקת מוצרים ציטוסוליים, כגון חלבונים ואברונים, לליזום. זה עוזר לשמור על הונוסטזיס הסלולר על ידי ביטול חלבונים פגומים, כמו גם אלה אשר חיו את חייהם.
אנחנו נעבוד עם זן מוטנטים שיש לו מחיקה של הגן ATG1. קודי ATG1 עבור קינאז חלבון סרין/threonine-חלבון הנדרש להיווצרות שלפוחית ו autophagy במסלול מיקוד ציטופלסמה-כדי vacuole. מוטציית האפס ATG1 יש פנוטיפ של בעל תוחלת חיים כרונולוגית קצרה באופן חריג.
במעבדת הזדקנות זו, נתכנן ונבדוק גורמים גנטיים שיכולים להציל, או לדכא, את תוחלת החיים המקוצרת באופן חריג האופיינית למוטנט האפס ATG1. עם זאת, ניתן להרחיב את זה גם לרקעים גנטיים קצרי מועד אחרים. השלב הראשון בתהליך זה הוא לזהות גן המקושר להארכת תוחלת החיים.
אנחנו נתמקד במיוחד בגנים שמאריכים את תוחלת החיים הכרונולוגית כשהם באים לידי ביטוי יתר. כדי לעשות זאת, אנו הולכים להשתמש בנתונים הזמינים לציבור הנגישים ממסד הנתונים של הגנום של השמרים. אנחנו הולכים לעלות לכאן.
חיפוש לפי פנוטיפ. ובמידת הדרך למטה, נראה שנוכל לבחור את תוחלת החיים הכרונולוגית. כדי לחפש גנים המגדילים את תוחלת החיים, מה שאתה יכול לראות הוא העושר של נתונים זמינים כי יש גנים הקשורים פנוטיפ מסוים זה.
היום, נלמד SIR2, אבן יסוד ליסטין הקשורה לתוחלת חיים כרונולוגית מורחבת כאשר היא באה לידי ביטוי יתר. הדבר הראשון שאנחנו נעשה הוא לגשת רצף ה-DNA לאזור הקידוד, כמו גם את האזורים הרגולטוריים כי האגף משני צדי הגן הזה. ניקח 400 זוגות בסיסים במעלה הזרם ובמורד הזרם כדי להיות בטוחים שאנחנו מקיפים את כל האזורים הרגולטוריים.
נשתמש ברצף הדנ"א הזה כדי לתכנן פריימרים של PCR שיאפשרו לנו לשבט את הגן הזה לווקטור הפלסמיד שלנו. אנו נשתמש PCR כדי להגביר את הגן שלנו כדי לשכפל אותו לתוך וקטור pRS315. כדי לעשות זאת, נתכנן פריימרים המכילים אתרי עיכול הגבלה המשלבים אתרי הגבלה של HindIII ו- SacII.
כפי שאתם יכולים לראות, הפלסמיד מכיל את שני אתרי ההגבלה, HindIII ו- SacII, שיקלו על השיבוט שלנו. עליך לעצב את פריימרים PCR שלך להכיל כ 21 או 22 נוקלאוטידים של רצף מחמיא לאזור שברצונך להגביר. בנוסף לרצף, תוסיף על חמשת הקצה העיקרי של אותם אתר ההגבלה המתאים, או HindIII על פריימר קדימה, או SacII על פריימר הפוך, המוצג כאן באדום וסגול בהתאמה, ובמעלה הזרם של זה, להוסיף כמה נוקלאוטידים שיאפשרו אנזים ההגבלה לאגד וליצור את אתר העיכול הגבלה ביעילות גבוהה יותר.
לגדל תרבות של חמישה מיליליטר של שמרים מסוג הבר בן לילה לשלב שלאחר הרישום במדיה מועשרת, כגון YPAD. קציר DNA גנומי באמצעות ערכה מסחרית זמינה כי הוא ספציפי לבידוד גנומי פטרייתי. חשוב כי הערכה היא ספציפית עבור שמרים, כפי שיש להם קיר תא נוקשה מאוד וקשה לחדור.
טיפול Zymolyase יעיל בעיכול קיר התא ומגביר מאוד את התשואה הגנומית. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את הכמות ואת איכות ה- DNA. כדי לייצר אמפייקון שמתאים לשיבוט, יש צורך לנצל פולימראז PCR נאמנות גבוהה, כדי למנוע מוטציות במהלך תהליך ההגברה.
ישנן ערכות PCR רבות ושונות באיכות גבוהה הזמינות באופן מסחרי. כדי להקל על אופטימיזציה של התגובה, אנו ממליצים לבחור ערכה המספקת מערכות אגירה מרובות, אחת שהיא מאגר נאמנות גבוהה סטנדרטי, ואחד ממוטב עבור תוכן GC גבוה באמפיקלונים מורכבים. אנחנו הולכים להוסיף 200 ננוגרם של הדנ"א הגנומי שלנו.
אנחנו הולכים להוסיף חמישה מיקרוליטרים של החיץ שלנו. אנחנו הולכים להוסיף 2 1/2 microliters של הקדמי שלנו ואת פריימרים הפוכים שלנו. אנחנו הולכים להוסיף מיקרוליטר אחד של הפולימראז שלנו, שני מיקרוליטרים של D NTPs.
ולאחרונה, אנחנו הולכים לQS כל התגובה ל50 microliters עם מים מזוקקים סטריליים. נריץ את התגובה לפי הפרוטוקול הספציפי לאנזים בו אנו משתמשים, כמו גם עבור פריימרים שתכננו בניסוי זה. לנקות ולרכז את תגובת PCR.
לגדל תרבות של חמישה מיליליטר של אי-קולי בן לילה במדיה סלקטיבית. גלולה התרבות על ידי צנטריפוגה ולהשליך את העל טבעי. יש להתרפק מחדש ולתלות את התאים במאגר הצ'אוטרופי שסופק למשך חמש דקות.
לנטרל את התגובה ולערבב את השניים על ידי היפוך חמש או שש פעמים. צנטריפוגה המדגם שלך במשך 10 דקות במהירות המרבית. מעבירים את העל-טבעי לעמוד סיליקה ושוטפים עם המאגר שסופק.
השלך את הזרימה דרך ולחזור על לשטוף עם מאגרים מתאימים אחרים, עם 30 צנטריפוגות השני בין, השלכת הזרימה שלך דרך אחרי כל אחד. בסוף, צנטריפוגה במשך שתי דקות נוספות כדי להסיר כל אתנול שיורית ולחמק plasmid שלך לתוך 20 מאגר אלוטיון microliters ולקבוע את הכמות והאיכות על ידי ספקטרופוטומטר. עכשיו הגיע הזמן להגדיר עיכול הגבלה של הווקטור והתוספה.
הוסף 625 ננוגרם של DNA, או וקטור או הכנס, חמישה microliters של חיץ CutSmart, מיקרוליטר אחד של SacII, מיקרוליטר אחד של HindIII, ו QS התגובה עם מים כדי להביא את נפח התגובה הסופי 50 microliters. דגירה עיכול ההגבלה ב 37 סנטימטרים במשך שלוש שעות, ואחריו 80 סנטימטר במשך 20 דקות כדי לחמם ולהפעיל את האנזימים. בשלב זה, תקצירים ניתן לאחסן בארבע מעלות לפני שתמשיך לשלב הבא.
לאחר מכן, אנחנו הולכים להקים 15 רצועות מיקרוליטר באמצעות שבר הגנומי המתעכל שלנו, כמו גם את הווקטור שהשלמנו זה עתה. נתחיל בהוספת שישה מיקרוליטרים של מים. אנחנו הולכים להוסיף שני מיקרוליטרים של הווקטור המתעכל שלנו.
זו הפלסמיד pRS315 שלנו. אנחנו הולכים להוסיף ארבעה מיקרוליטרים של התוספת שלנו, הגן SIR2. אנחנו הולכים להוסיף שני מיקרוליטרים של מאגר הרצועות שלנו, במקרה מאגר 10X.
ולאחרונה, נוסיף מיקרוליטר אחד של הליגה. אנחנו הולכים להאדיר את זה ב16 מעלות לילה, ולאחר מכן חום להרוג את האנזים ב 80 מעלות צל"ש במשך 20 דקות. כדי לסנן את הפלסמיד שנוצר בהצלחה, נהפוך אותו לאי-קולי.
נשתמש ב-50 מיקרוליטרים של תאים מוכשרים מבחינה כימית. אנחנו הולכים להפשיר אותם על קרח, וברגע שהם מפשירים, אנחנו הולכים להוסיף תגובת הקשירה שלנו, אנחנו הולכים להוסיף את כל התוכן של זה. אז אנחנו הולכים להוסיף 15 microliters של הקשירה עם הכנס, ואנחנו הולכים להוסיף 15 microliters של בקרת ללא הכנסה שלנו, כמו גם לתגובה נפרדת.
לאחר הוספתו, תלחץ על הצינור כמה פעמים כדי לערבב אותו. ואנחנו הולכים להחגירה זה על קרח. לאחר השלמת הדגירה של 30 דקות על קרח, נוסיף את הדגימות שלנו לבלוק חימום של 42 מעלות שבו נהדקר ונחמם הלם למשך 20 שניות, איזו נקודה נוריד אותן, ונוסיף תקשורת התאוששות.
אחרי הלם החום, נאפשר תקופת החלמה. אנחנו ניקח את הדגימות שלנו ונוסיף 450 מיקרוליטרים של מדיה SOC. אנחנו נדוג אלה ב 37 מעלות צלסיגרד כדי לאפשר את הפלסמידים להיות הרים ולאפשר את גן ההתנגדות אמפיצילין להתחיל לבוא לידי ביטוי.
אנחנו נאפשר לדגימות האלה להתאושש ב-37 מעלות למשך 45 דקות. אחרי הדגירה הזאת, אנחנו קובעים סדרה של דילולים, אחד עד 10, ואחד עד 100, ואנחנו הולכים צלחת אלה על מדיה LB / Amp ולאפשר לתאים לגדול בן לילה. אנחנו צלחת אותם באמצעות טכניקה סטרילית.
ניקח את הצלחת המתאימה, אשר יש לנו שכותרתו בהתאם ומכיל הסמן שלנו לבחירה. אנחנו ניקח 150 מיקרוליטרים של ה-E.coli המשתנה שלנו. באמצעות לולאת חיסון סטרילית, לאחר מכן נפזר בעדינות את התאים לאורך ולאורך כל הצלחת כך שנקבל חלוקה אחידה ונחמדה.
ברגע שנסיים ציפוי כל הדילולים שלנו, אנחנו לה הדגירה צלחות אלה לילה ב 37 מעלות צל"ש כדי לראות מה גדל. אחרי יום בערך, אנחנו צריכים לראות מושבות גדלות שבתקווה מכילות את הפלסמיד שאנחנו מנסים ליצור. הם צריכים להיראות משהו כזה.
באמצעות טכניקה סטרילית, לחסן טרנספורמטים פוטנציאליים שגדלו מן הטרנספורמציה שלך לתוך חמישה מיליליטר LB בתוספת אמפיצילין בעקבות ההליך שתואר קודם לכן. לבודד את הפלסמידים מכל טרנספורמנט פוטנציאלי ולהפעיל עיכול הגבלה כפי שתואר קודם לכן. הפעל את מוצרי התגובה על ג'ל אגרוז, השוואת הטרנספורמנטים הפוטנציאליים לווקטור הריק.
שמור את כל הטרנספורמנטים שתוצאתם כריתה של הכנס בגודל מתאים למחקר נוסף. לאחר שיצרנו בהצלחה את הפלסמיד שלנו, אנחנו הולכים להפוך אותו לרקע שמרים NULL ATG1. אנחנו הולכים לקחת 15 מיל של תאים ואנחנו הולכים גלולה אותם, שכבר עשיתי ממש כאן.
לאחר שהם כבר גלולה, להסיר את התקשורת YPAD כי הם גדלו ולשטוף את התאים עם מים מזוקקים. אחרי זה, אנחנו הולכים לקחת את התאים ואנחנו הולכים למנוסה אותם ב100 מילימולר ליתיום אצטט. אנחנו הולכים למנוסה אותם מחדש ב200 microliters של זה.
תן מחדש את גלולת התא על ידי צינורות עדינים למעלה ולמטה. לפצל את התאים לתוך צינורות microfuge נפרדים עבור כל אחד מהטרנספורמציות שתבצע, באמצעות 50 microliters של תערובת זו לכל טרנספורמציה. לכל אחת מהטרנספורמציות, יהיה עליך להוסיף 240 מיקרוליטרים של 50%PEG.
PEG הוא צמיג מאוד, פיפטה ולמדוד בזהירות רבה. מערבבים על ידי צינורות לאחר הוספת PEG ואחרי כל אחד מהרכיבים הנוספים. לאחר מכן מוסיפים 36 מיקרוליטרים של ליתיום אצטט טוחן אחד, חמישה מיקרוליטרים של דנ"א זרע סלמון, או דנ"א נשא אחר, כי כבר מבושל במשך חמש דקות והניח על קרח, ולבסוף חמישה microliters של פלסמיד עבור כל טרנספורמציה אתה תבצע.
מערבולת כל צינור ביסודיות לערבב. דגירה הדגימות שלך ב 30 מעלות צל"ש במשך 45 דקות. החום מזעזע אותם ב-42 ס"מ למשך 10 דקות, ואז שוטף את התאים פעם אחת במים סטריליים, ולבסוף מחדש אותם ב-200 מיקרוליטרים של מים סטריליים.
הגדר אחד עד 10 ואחד עד 100 דילולים של כל אחד הזנים שהפכו של שמרים צלחת 150 microliters על SC מינוס צלחות לאו כדי לבחור עבור plasmids. מורחים את התאים באופן אחיד ושווה, ומאפשרים לצלחות להתייבש לפני היפוך ודגירה ב 30 מעלות צלסיאדה, ומאפשר להם לגדול במשך 48 עד 72 שעות. ברגע שנצליח לשכפל את הגן שלנו לבדיקה, נבדוק את ההשפעה על תוחלת החיים הכרונולוגית של האורגניזם.
אנחנו נגדל את השמרים, ניטור מספר המושבה קיימא להרכיב יחידות שנותרו כפונקציה של זמן. לגדל את השמרים הראשון במשך 72 שעות ב SC מינוס לאוצין נוזלי מדיה עם רועד ב 30 מעלות צלסיאדה. באמצעות hemocytometer, לקבוע את הדילול הדרוש כדי לאפשר לך צלחת 500 תאים.
באמצעות טכניקה סטרילית, צלחת התאים על לוח SC מינוס leu, המאפשר לו להתייבש דגירה הפוכה במשך שלושה ימים ב 30 מעלות צל"ש, בשלב זה הם יגדלו ואתה יכול להבקיע את צמיחת המושבה ותקליט את נקודת הזמן. לאחר ביצוע הצלחת, ממשיכים להחגירה השמרים שלך ב 30 מעלות צלסיגרד בלי לרעוד. בתחילה, אנו חוזרים על ציפוי במרווחי זמן שבועיים, לוקח נקודות זמן תכופות יותר אם הנתונים הראשוניים שלנו מרמז על דיכוי של פנוטיפ ההזדקנות.
על מנת לקבוע את אחוז הכדאיות, אנו מנרמלים ליום נקודת זמן אחת לניתוח. הקפד צלחת אותו דילול בכל מרווח. המשך בתהליך זה עד שלא תראה עוד מושבות גדלות.
מומלץ להזין את המידע שלך בגיליון אלקטרוני של Excel. זה יאפשר לך לקבוע במהירות את הכדאיות של כל זן בסיום הניסוי.
