Бактериальная система CRISPR-Cas9 значительно увеличила экспериментальные возможности для ученых-жизненных работников. Однако несколько подходов CRISPR зависят от одновременной доставки нескольких направляющий РНК в отдельные ячейки. Клонирование сборки струн gRNA позволяет простое и быстрое генерацию векторов экспрессии мультиплекса gRNA в одном шаге клонирования.
Но STAgR не только прост, но и эффективен, дешев и прост в настройке. Для начала добавьте последовательности N20 gRNA к форвардным грунтовким усиления для строки ДНК STAgR в качестве свесов. Добавить смысл gRNA последовательности пять премьер вперед грунтовки, Scaffold вперед грунтовки, для обычных эшафот, или SAM вперед грунтовки для MS2-содержащих эшафот.
Затем добавьте обратное дополнение N20 gRNA последовательностей к обратным последовательности грунтовки, выбирая RP грунтовки, в зависимости от конкретных промоутеров и используемых строк. Чтобы начать генерацию отдельных фрагментов клонирования для Gibson Assembly, перенесите 10 микролитров буфера высокой точности в трубку. Добавьте один микролитер из 10 милимоляров и 0,25 микролитров обоих 100 микромолящих свесных грунтовок.
Добавьте 10 нанограмм строки шаблона ДНК, или вектора, и 1,5 микролитров DMSO. Добавьте достаточно воды, чтобы довести конечный объем до 49,5 микролитров, а затем добавить 0,5 микролитров полимеразы HF. Инкубировать реакции на термоциклер, как указано в текстовом протоколе.
После этого возьмите 5,5 микролитр aliquot от реакции ПЦР. Добавьте погрузочный краситель ко всем алицитам и загрузите его на гель 1%agarose. Загрузите соответствующую лестницу ДНК для размера, и запустить гель в соответствующий гель работает буфер на 120 вольт в течение 30 минут.
Пока гель работает, добавьте пять микролитров буфера, обеспеченных ферментом ограничения, и 0,5 микролитров DpnI к оставшимся 44,5 микролитров векторной реакции ПЦР для удаления остаточного плазмидного шаблона, используемого во время ПЦР. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30-60 минут. Проверьте, чтобы убедиться, что amplicons являются правильный размер.
Чтобы начать очистку ДНК, добавьте 1,8 микролитров магнитных бусин на один микролитр продукта ПЦР и смешайте с помощью трубок вверх и вниз. Инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут. Используя магнит, отделяйте бисер в фрагментах ДНК от остаточной жидкости.
Промыть гранулы с 70%этанола без полного повторного перерасхода его, чтобы вымыть бисер. Повторите эту стирку еще раз. Используя пипетку, удалите весь этанол и дайте гранулам высохнуть.
Затем добавьте от 15 до 20 микролитров воды, и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать и растворить гранулы. Используйте магнит, чтобы отделить бисер от жидкости. Перенесите чистый супернатант в новую трубку.
После этого используйте спектрофотометр для определения концентрации ДНК. Во-первых, подготовьте 5x изотермальный буфер реакции, описанный в текстовом протоколе. Для Gibson Assembly Master Mix объедините 320 микролитров 5x изотермального буфера реакции с 697 микролитров воды.
Добавьте 3 микролитров экзонуклеазы T5, 20 микролитров полимеразы ДНК и 160 миролитров ДНК-лигазы Taq. Перенесите 7,5 микролитров сборки Master Mix на свежую трубку. Затем добавьте 2,5 микролитров вставки в вектор, как указано в текстовом протоколе.
Инкубировать образцы при 50 градусах по Цельсию в течение 45 до 60 минут. После этого храните образцы на льду, или при 20 градусах по Цельсию, для последующей трансформации. Когда готовы к преобразованию бактерий, оттепель химически компетентных TOP10 E.Coli бактерий на льду.
Далее добавьте пять микролитров Gibson Mix в 50 микролитров компетентных бактерий и смешайте, аккуратно щелкнув дно трубки. Инкубировать на льду в течение 30 минут. Поместите трубку в 42 градусов по Цельсию водяной бане или тепловой блок в течение 45 секунд, чтобы тепло-шок бактерий.
Затем поставь трубки обратно на лед. Добавьте 250 микролитров среды SOC к бактериям, и дайте им восстановиться при 37 градусах По Цельсию в трясущимся инкубаторе в течение 30-45 минут. После того, как бактерии выздоровели, пластины их на 1,5%LB Агар пластин, которые содержат 100 микрограмм на миллилитр ампициллина.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение ночи. Для начала подготовьте по крайней мере два набора из 200 микролитров ПЦР реакционной трубки для каждой конструкции. Заполните один из наборов реакционной трубки с 100 микролитров LB среды, содержащей 100 микрограмм на миллилитр ампициллина.
Используя наконечник стерильной пипетки, отцарапайте биологический материал из одной бактериальной колонии и распределите его на дне пустой 200-ми микролитровой реакционной трубки ПЦР. Немедленно перенесите наконечник пипетки на вторую соответствующую реакционной трубку, которая содержит LB-среду. Закружить кончик вокруг, чтобы убедиться, что некоторые бактерии передаются в СРЕДСТВА массовой информации LB.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию для более длительного использования. Затем подготовьте 10 микролитров PCR Master Mix на реакционной трубке, как указано в текстовом протоколе. Добавьте 10 микролитров PCR Master Mix к помеченным трубкам реакции ПЦР, без средств массовой информации LB.
Используя термоциклер, инкубировать реакции, изложенные в текстовом протоколе. После этого добавьте погрузочный краситель к усиленным фрагментам и загрузите их на гель 1%agarose. Загрузите соответствующую лестницу ДНК для размера, и запустить гель в соответствующий гель работает буфер на 120 вольт в течение 30 минут.
Рассчитайте теоретический размер ампликона, добавив индивидуальные размеры используемых промоутеров, леса gRNA и количество последовательностей N20. По результатам колонии ПЦР, определить бактериальные клоны, на основе правильного размера полосы, и являются ли они могут гавани правильные векторы. Используя соответствующую культуру микролитров 100, привить 2,5 миллилитра ночь LB культуры, содержащей 100 микрограмм на миллилитр ампициллина.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 12 часов. Затем используйте коммерческий плазмидный мини-комплект для извлечения плазмидной ДНК, в соответствии с инструкциями производителя. В этой процедуре для быстрого генерации плазмидов экспрессии гРНК используется клонирование струнной сборки.
Типичный результат ПЦР, используемых для получения частей STAgR, виден здесь. Шесть ампликонов представляют линейные части ДНК, каждая из которых содержит отдельные последовательности GRNA N20 на их концах. Плазмидная основа расширена с таргетингом последовательностей gRNA1 и gRNA6, и поэтому обладает необходимыми перекрытиями до двух других ПЦР для Гибсон Ассамблеи.
После очистки может быть достигнута доходность ДНК по крайней мере одного микрограмма для векторов и вставок. После ассамблеи Гибсона бактериальная трансформация приводит к 100-700 бактериальным колониям. Репрезентативный анализ 22 бактериальных колоний, через колонию PCR после протокола STAgR с шестью кассетами gRNA, показывает, что семь клонов показывают ожидаемый размер ампликона для полной сборки.
Другие клоны, вероятно, получили векторы STAgR, содержащие от одной до пяти гРНК-кассет, в то время как один клон полностью пуст. После освоения, этот метод может быть сделано в течение нескольких часов. Выполнено должным образом, это позволяет генерации множества мультиплексных векторов экспрессии гРНК менее чем за рабочую неделю.
При попытке этой процедуры, важно обратить внимание на правильное назначение и сочетание N20 свес грунтовки. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как создать свой собственный мультиплекс руководство РНК выражения векторов.
