Этот протокол можно использовать для оценки прикрепления к нуклеоскелету, а не с помощью секвенирования DamID, и это анализ одной клетки. Основное преимущество использования этого метода заключается в том, что он экономичен и легко доступен. Это может выявить функциональные различия между генами и хромосомами, которые обычно не встречаются при других методах визуализации.
С помощью этого протокола можно оценить пространственные и функциональные организации в геноме обработанных раковых клеток и клеток прогерии, а также геномные поведенческие различия в стареющих клетках. Этот метод может быть применен к любому типу клеток или тканей на протяжении всей жизни и при любом заболевании. Он также может быть использован в модельных организмах, где доступны зонды.
Для начала подготовьте 500 миллилитров 10%-ной соляной кислоты и вылейте ее в большой стакан. Капните микроскоп по отдельности в кислоту и инкубируйте их в течение одного часа при комнатной температуре на шейкере, установленном на два г. Сцедите кислоту из стакана и промойте предметные стекла 10 раз в водопроводной воде. Затем еще 10 раз в деионизированной воде.
Промойте предметные стекла в метаноле дважды и держите их в метаноле до стерилизации. Положите слайды на бумажное полотенце, чтобы они высохли, и заверните их в фольгу для стерилизации в автоклаве или горячей духовке. Выращивайте клетки в соответствующей среде с сывороткой в течение не менее 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока не будет достигнуто слияние от 60 до 70%.
Соберите каждый тип клеток и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Высевают один раз по 10 до пяти ячеек по 10 миллилитров среды на одно горное стекло. Извлеките из инкубатора культуральную чашку, содержащую предметные стекла и прикрепленные клетки.
Откажитесь от носителя и пометьте слайды карандашом. Затем поместите их в банку из-под коплина, содержащую 50 миллилитров ледяного буфера цитоскелета. Выдерживайте банку 15 минут на льду или при четырех градусах Цельсия.
Откажитесь от буфера цитоскелета и быстро промойте предметные стекла в 50 миллилитрах одноразового гало-буфера ДНК три раза, окунув их в банку Коплина с буфером. Переложите предметные стекла в банку Коплина, содержащую 50 миллилитров экстракционного буфера, и инкубируйте в течение четырех минут при комнатной температуре. Затем последовательно инкубируют предметные стекла в 50 миллилитрах 10 раз, пять раз, два раза и один раз ДНК гало буфера в течение одной минуты каждый.
Когда закончите, окуните слайды в последовательную серию этанола из 10, 30, 70 и 95% этанола. Проведите слайды через последовательную серию этанола объемом 50 миллилитров из 70, 90 и 100% этанола в течение пяти минут каждый. Сушите их на воздухе на согревающей тарелке.
Затем выпекайте в духовке при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут. Денатурируйте предметные стекла, поместив их в 70% формамид два раза в раствор SSC на две минуты при 70 градусах Цельсия. Поместите денатурированные предметные стекла в 50 миллилитров ледяного 70% этанола на пять минут.
Затем переместите их через серию этанола 90, 95 и 100% при комнатной температуре в течение пяти минут каждый. Когда закончите, высушите слайды на воздухе на согревающей плите. Денатурируйте ДНК-зонды при 75 градусах Цельсия в течение 10 минут в горячем блоке или на водяной бане.
Затем инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, прежде чем пипетировать 10 микролитров на соответствующее предметное стекло. Накройте зонд покровным стеклом размером 21 на 21 миллиметр и запечатайте его резиновым цементом. Инкубируйте предметные стекла не менее 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненной гибридизационной камере.
После инкубации аккуратно удалите резиновый цемент щипцами. Затем инкубируют предметные стекла в 50 миллилитрах 50%-ного раствора формамида два раза SSC при рН семь, предварительно нагретом до 45 градусов Цельсия в течение трех пятиминутных инкубаций. Затем поместите предметные стекла в 50 миллилитров 0,1-кратного раствора SSC, предварительно нагретого до 60 градусов Цельсия, но помещенного на водяную баню с температурой 45 градусов Цельсия.
Инкубируйте в течение пяти минут и дважды замените буфер для пятиминутной инкубации. Поместите предметные стекла в банку для коплина, содержащую 50 миллилитров четырехкратного раствора SSC при комнатной температуре, и инкубируйте в течение 15 минут с тремя сменами буфера. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител, нанесите 100 микролитров 4%-ного раствора BSA четыре раза SSC на каждое предметное стекло и наложите на него кусок парафиновой пленки.
Инкубировать при комнатной температуре 10 минут. Затем инкубируют предметные стекла со 100 микролитрами стрептавидина Cy3, разбавленного один на 200, в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы обнаружить меченый зонд. Поместите предметные стекла в банку для коплина, содержащую 50 миллилитров четырехкратного раствора SSC при комнатной температуре, и инкубируйте в течение 15 минут с тремя сменами буфера.
Установите слайды в 20 микролитров монтажного раствора, содержащего DAPI, и наложите покровное стекло размером 22 на 50 миллиметров. Визуализируйте ореолы ДНК и хромосомные территории с помощью эпифлуоресцентного микроскопа со 100-кратным масляным объективом. Подготовка ореола ДНК позволяет увидеть край остаточного ядра, ДНК, оставшуюся внутри остаточного ядра, и неприкрепленную ДНК, которая наматывалась в окружающую область.
Ореолы ДНК пролиферирующих дермальных фибробластов человека были созданы из клеток с инкорпорированным BRDU и впоследствии окрашены антителами против BRDU. Пролиферирующие клетки были положительными на BRDU и анти-pKi-67. Этот протокол использовался для визуализации хромосомных территорий в ореолах ДНК.
Отдельные хромосомы были помечены специфическими зондами для окрашивания хромосом всего плеча для хромосом 1, 13, 17 и 18. Anti-pKi-67 был использован для маркировки пролиферирующих клеток и его отсутствия в одной культуре. Здесь показаны препараты ДНК-ореола с теломерами зеленого цвета.
Можно наблюдать пропорцию теломер в ореоле ДНК, особенно на втором изображении эксперимента. Средний процент теломер составлял примерно 17% в покоящихся клетках. Различия в прикреплении хромосом были обнаружены в фибробластах первичного контроля и в больных клетках с типичным и атипичным синдромом прогерии Хатчинсона-Гилфорда, экспрессирующими различную изоформу Sun1 и не имеющими мутации ламина А.
Хромосомы номер один и 13 демонстрируют статистически значимые различия в их прикреплении в остаточных ядрах по сравнению с контролируемыми ореолами ДНК. Положение всей территории хромосомы коррелировало с остаточным ядром и ореолом ДНК. При использовании этого протокола убедитесь, что клетки засеяны с правильной плотностью и извлечены в нужное время.
После этой процедуры может быть выполнена непрямая иммунофлюоресценция и РНК-FISH.
