Этот метод поможет проиллюстрировать молекулярные механизмы многогранных биологических явлений. Такие как механобиология, оптическая электрофизиология и визуализация белков ДНК / РНК со сверхвысоким разрешением с использованием автоматических методов визуализации живых клеток. Этот протокол обеспечивает автоматическую, многофункциональную, высокопроизводительную, самокорректирующуюся коррекцию дрейфа и долгосрочное получение изображения.
Он совместим с большинством флуоресцентных микроскопических платформ, таких как NYCOM. Любой, кто пробует эту технику впервые, должен понимать функцию каждого шага, а не только строго следовать протоколу, чтобы обеспечить успешный эксперимент. Начните с размещения камеры окружающей среды на моторизованной ступени перевернутого микроскопа.
Установите скорость потока CO2 на уровне 160 миллилитров в минуту и отрегулируйте температуру камеры. Затем добавьте 40 миллилитров очищенной воды в ванну камеры. Выньте стеклянную чашку Петри с клетками из инкубатора и поместите ее в камеру окружающей среды.
Включите конфокальный контроллер и перевернутый микроскоп. Переключите световой контур вправо. Наблюдайте за присоединением ячеек с помощью Micro Manager.
Если к гелю прикреплено достаточное количество клеток, перенесите чашку Петри обратно в инкубатор. Если нет, продолжайте инкубацию клеток еще 30 минут для B2B и 60 минут для рака легких или клеток PC-9. Отрежьте 2 небольших кусочка скотча и наклейте их на камеру вокруг круглого отверстия.
Затем нанесите немного клеевого клея на область ленты, которую покроет чашка Петри. Достаньте чашку Петри из инкубатора. Медленно поместите чашку Петри в камеру и дайте дну чашки соприкоснуться с клеем.
Прижмите крышку чашки Петри в течение 1 минуты, чтобы клей полностью соприкоснулся с чашкой Петри и затвердел. Осторожно надавите на чашку Петри горизонтально, чтобы убедиться, что клей затвердел и чашка Петри не двигалась. Затем закройте крышку камеры.
Откройте IntelliJ и задайте параметр T1 в строке 93 файла elements_script.java. Убедитесь, что это значение больше времени выполнения макроса и элементов, используемых для конфокальной визуализации одного поля зрения. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы запустить проект AMFIP IntelliJ.
Нажмите кнопку live и multi-deacquisition на главном интерфейсе Micro Manager, затем переключите световой путь перевернутого микроскопа вправо для получения изображения яркого поля. Переключитесь на 10-кратную цель и откройте светодиодный свет с установленной интенсивностью 5% Нажмите на объектив микроскопа светового пути и кнопку светодиодной лампы в панели элементов TI2. Отрегулируйте джойстик XY и ручку плоскости Z, чтобы найти правильное положение и плоскость фокусировки геля на чашке Петри.
Используйте объектив 10 раз, чтобы найти соответствующие поля зрения нескольких отдельных клеток, прикрепленных к гелю. Установите флажок XY с несколькими позициями в окне многомерного сбора. Нажмите на кнопку редактирования списка позиций и посмотрите на всплывающее окно списка позиций сцены.
Измените цель на 40 раз, увеличьте интенсивность светодиодного света до 15% Перенастройте моторизованную сцену XY, чтобы найти поля зрения и записать координаты, нажав на кнопку отметки в окне списка позиций сцены. Запишите от 6 до 7 желаемых полей зрения. Нажмите кнопку сохранить как в окне списка позиций сцены, чтобы записать координаты и ввести T1 в качестве временного интервального раздела получения изображения в T1 в разделе точки времени в многомерном окне сбора.
Откройте элементы, измените траекторию света вправо для конфокального изображения и выключите светодиодный свет. Затем нажмите кнопку снятия блокировки и включите лазерный канал FITC для визуализации YAP, установив флажок FITC. После регулировки скорости сканирования до 1 кадра в 2 секунды покрутите ручку плоскости Z, чтобы быстро найти положение Z прикрепленных ячеек.
Запишите нижний и верхний пределы для стека Z. Щелкните макрос на верхней ленте, выберите редактор макросов в раскрывающемся меню макросов и введите нижний и верхний пределы стека Z в файл макроса. Включите лазерный канал DAPI для визуализации бисера, установив флажок DAPI, чтобы найти и записать сфокусированное положение бусин Z.
Перейдите в редактор макросов и введите записанные значения в файл макроса. Чтобы задать задачу перемещения моторизованной ступени с помощью AMFIP, зайдите в Micro Manager, нажмите на плагины автоматизации, чтобы открыть графический пользовательский интерфейс AMFIP. Затем нажмите кнопки «Добавить точку» или «Удалить точку», чтобы получить точное количество выбранных полей зрения.
Введите записанные координаты полей зрения в панель координат. Определите общее время эксперимента в текстовом поле общее время эксперимента. Нажмите на кнопку дополнительной настройки времени и определите временной интервал T2 перемещения моторизованной ступени к каждому FOV.
Разверните размер окна элементов и перетащите графический интерфейс AMFIP в правую часть экрана, чтобы графический интерфейс не мешал автоматическим операциям курсора, а затем нажмите кнопку ввода. После завершения первого макроса. нажмите на кнопку приобретения в многомерном окне приобретения.
После завершения долгосрочной визуализации остановите задачу AMFIP, нажав кнопку паузы в окне плагина автоматизации и кнопку остановки в многомерном окне сбора. Откройте элементы и задайте образ стека Z, щелкнув верхнюю и нижнюю кнопки в окне получения ND. Переключите световой контур вправо и откройте светодиодный индикатор.
Медленно и осторожно снимите крышки камеры и чашки Петри, контролируя яркий вид поля зрения для любого дрейфа поля зрения. Используйте пластиковую пипетку, чтобы взять 0,5 миллилитра раствора SDS. Осторожно подержите пластиковую пипетку немного выше питательной среды в чашке Петри и добавьте в питательную среду от 1 до 2 капель раствора SDS.
Как только ячейки и яркий вид поля растворяются, закройте светодиодный индикатор, переключите световой путь влево, нажмите кнопку снятия блокировки. Запустите образ стека Z и сохраните стек изображений как reference_N, где N — порядковый номер каждого поля зрения. Нажмите на кнопку XY с несколькими позициями в окне многомерного сбора.
Затем выберите следующее поле зрения и нажмите на кнопку перехода, чтобы переместить моторизованную стадию во второй FOV. Повторите этот шаг для каждого поля зрения. Ядерная локализация представляет собой yes-ассоциированный белок или YAP в B2B эллах, увеличенных с увеличением жесткости субстрата, тогда как клетки PC-9 показали аналогичную концентрацию YAP в ядре и цитоплазме на субстратах различной жесткости.
B2B-клетка монотонно увеличивала площадь распространения с течением времени, наряду с уменьшением отношения yaP-ядра к цитоплазме, в то время как клетка PC-9 поддерживала сравнительно неизменную область распространения клеток, ориентацию и отношение yaP к цитоплазме в течение 10-часового процесса распространения. В течение 10-часовой продолжительности раннего распространения репрезентативная B2B-клетка конститутивно деформировала поверхность субстрата и применяла время, развивая тягу клеток по всей площади клетки. Напротив, репрезентативная клетка PC-9 развивала смещение и вытяжение только на 2 концах тела клетки, и ее тяга уменьшалась через 7,5 часов.
Отношение yaP к цитоплазме и дипольное вытяжение B2B-клеток, по-видимому, следуют двум различным тенденциям, предполагая, что в эксперименте могли существовать две группы B2B-клеток. В первой группе отношение ядра YAP к цитоплазме и дипольная тяга увеличивались вместе с увеличением площади распространения клеток и достигали своих максимумов примерно в 1000 квадратных микрометров. Во второй группе отношение yaP к цитоплазме и дипольное вытяжение увеличивались медленнее с увеличением площади распространения клеток и поддерживали почти постоянные значения, когда площадь распространения клеток продолжала увеличиваться.
Диапазоны стека Z для всех лазерных каналов должны быть тщательно определены, чтобы преодолеть потенциальный дрейф поля зрения во время движения стадии в долгосрочной визуализации. Этот новый метод обеспечивает автоматическую, неинвазивную долгосрочную и многопозиционную визуализацию и может помочь прояснить механизм молекулярной биологии, который требует временного и пространственного отслеживания клеток и органелл.
