Этот протокол демонстрирует, как исследовать секрецию клеток с помощью живой визуализации с помощью микроскопии TOF и предоставляет инструменты для обнаружения кластерных событий или регионов повышенной активности. Используя этот протокол, мы можем генерировать клеточные культуры на поверхностях микропаттернов, которые нормализуют деление клеток и тем самым облегчают специальные диапазоны секретных событий. Клетки выделяет различные макромолекулы, которые играют важную роль в иммунной регуляции.
При раке дерегулированная секреция влияет на высвобождение протеолитических ферментов, способствующих вторжению. Количественная оценка секреции позволит нам лучше понять деградированных секреции при раке и других динамических процессов, таких имеет антиген презентации. Хотя наш протокол визуализации и анализа прост, он требует генерации одиночных ячеек, которые хорошо распределены по куску микропаттерна.
В этом видео мы продемонстрируем, как культуры клеток на micropattern coverslips и как визуализировать и анализировать секретные события с помощью спациальных статистических инструментов. Для подготовки крышки для микропаттернов, активировать этанол стерилизованы 25 миллиметров диаметром стеклянные крышки под глубоким ультрафиолетовым светом в течение пяти минут. В то время как coverslips активируются, добавить один 30 микролитер капли полиэтиленового трансплантата полиэтиленгликоль на крышку на кусок парафиновой пленки во влажной камере.
В конце активации поместите крышки активированной поверхности вниз на капли и накройте влажную камеру для часовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть крышки два раза в дистиллированной воде. Пока крышки высыхают, смойте кварцевую фотомышку один раз дистиллированной водой и один раз с алкоголем.
Высушите фотомысок с фильтрованным потоком воздуха и подвергайте фотомой маске хромированную сторону до глубокого ультрафиолетового света в течение пяти минут. В конце освещения добавьте 10 микролитровых капель воды на хромированную сторону каждой фотома маски и поместите полиэтиленгликольную сторону каждой крышки на каждую каплю воды. После удаления излишков воды, поместите крышку пленки над слайдами, чтобы избежать обезвоживания.
Выставить нехом хромированные покрытием стороны фото маски для глубокого ультрафиолетового света в течение еще пяти минут, прежде чем добавить избыток воды в фото маски для удаления coverslips. Этот шаг будет производить микропаттерн отпечатки на поверхности. Затем инкубировать крышки в внеклеточной матрицы белкового раствора на парафиновой пленке во влажной камере в течение одного часа под капотом ламинарного потока.
Для посева клеток на подготовленную поверхность микропаттерна, в конце инкубации, поместите крышки в магнитную крышку держателя микропаттерна вверх и сразу же добавьте среду шаблона к обложкам. После добавления уплотнения, обездвижить крышки с магнитным устройством, прежде чем заполнить держатель крышки с дополнительной средой шаблона. Затем закройте держатель стеклянной крышкой.
Когда клетки будут готовы, добавить 5 раз 10 к 5-й из трансфицированных увековеченных пигментных пигментов сетчатки эпителиальных клеток к coverslips и инкубировать клетки в держателе в течение 10 минут в инкубаторе культуры клеток. В конце инкубации используйте одну пипетку для аспирации старой среды, используя вторую пипетку для мытья клеток пять раз со свежей средой на стирку, чтобы удалить неприсоеленные клетки и любую остаточную сыворотку крупного рогатого скота плода. После последней стирки верните держатель в инкубатор на три часа, чтобы обеспечить полное распространение клеток.
Для изображения событий экзоцитоза поместите держатель крышки под общий внутренний флуоресцентный микроскоп отражения, и поиск клетки, выражаюной VAMP7-pHluorin, который полностью распространяется. Изменение угла лазера до полного внутреннего отражения флуоресценции угол, который позволяет визуализации VAMP7-pHluorin экзоцитоза событий достигнут и выполнить пятиминутное приобретение на частоте, совместимой с скоростью экзоцитоза и сроки. Чтобы получить координаты экзоцитоза, откройте приобретенный фильм об экзоцитозе на Фиджи и вручную определите события экзоцитоза по появлению яркого сигнала, который распространяется наружу.
Используйте точечный инструмент, чтобы отметить центр события экзоцитоза и использовать анализ и измерение для измерения х и у-координат, а также временной координаты. Сохраните измерения одной ячейки в одном текстовом файле. Откройте текстовый файл в электронной таблице и удалите все столбцы, кроме среза x и y-coordinate.
Затем используйте овальный инструмент и меру для измерения центра и диаметра и получения х и у-координат и диаметра Фере каждой клетки. Сохраните измерения всех ячеек в одном текстовом файле. Откройте текстовый файл в электронной таблице и удалите все столбцы диаметра x и y-coordinate и Feret.
Затем добавьте измерение радиуса для каждой ячейки, а затем получите радиус от диаметра Ферета для каждой клетки. Используйте инструмент прямой линии для измерения толщины кольца микропаттерна каждой ячейки. Сохраните это измерение для всех ячеек в одном текстовом файле, а затем разделите длину адгезии на радиус клетки для расчета нормализованной длины адгезии.
Для пространственного анализа одной ячейки сначала установите пакет RStudio и загрузите пакет в RStudio. Вы запустите пакет с функцией ESA. Откроется пользовательский интерфейс, а затем выберите каталог для файлов TXT набора данных и каталог для выходных участков.
Скрипт автоматически запустит и выполнит анализ, предоставляя PDF-файлы соответствующих участков и файлы TXT, содержащие численные результаты. Внутри клетки пол в зонде утоляется низким рН лизосомы, но во время экзоцитоза, рГлуорин начинает излучать сигнал, как рН увеличивается из-за протонного выпуска. Сигнал рГлуорин демонстрирует пик во время экзоцитоза, который представляет собой быстрое высвобождение лизосомальных протонов, а затем экспоненциальный распад сигнала, который представляет собой 2D диффузию зонда на плазменной мембране.
Как правило, трансфект увековечил человека сетчатки пигментированных эпителиальных клеток демонстрируют важную лизосомальную активность секреции со средней скоростью экзоцитоза 0,28 Герц. Можно визуализировать 2D распределение экзоцитоза путем оценки плотности ядра, чтобы выявить различия в местной плотности. Существует три возможных отклонения от полной пространственной случайности: кластеризация, дисперсия или смесь кластеризации и дисперсии.
Функция K Рипли может быть использована для оценки этих отклонений. Следует отметить, что экзоцитозные явления в неклейной области также группируются, что указывает на то, что молекулы адгезии не являются единственными структурами, которые вызывают секреторные горячие точки на плазменных мембранах. Построение гистограммы экзоцитоза событий в соответствии с модулом для репрезентативной ячейки показывает пик вокруг границы между клейкой и неклейной областях.
Парный анализ показывает, что плотность поверхности ниже в области адгезии, чем в области неприсолиза, потенциально из-за сильного снижения экзоцитоза на периферии клеток. Сочетание клеточной адгезии на микропаттернах со статистическим анализом облегчает возможность определить, как регулируются сложные клеточные процессы, такие как секреция в пространстве. Необходима более будущая работа, чтобы определить, какой молекулярный механизм, который лежат в основе кластеризации секретоорийной деятельности.
