Этот метод позволит оценить роль полости перикарда, окружающей сердце, и ее содержимого в восстановлении сердца после инфаркта миокарда. По сравнению с обычными методами коронарного лигирования для моделирования инфаркта миокарда, наш метод поддерживает неповрежденную полость перикарда, позволяя определять содержимое и отслеживать их роли после ишемического повреждения сердца. Понимание вклада полости перикарда и реакции на повреждение сердца даст важное представление о терапевтических стратегиях, которые нацелены на перикард для улучшения заживления сердца.
Для начала после обезболивания удерживайте лапы мыши и расположите ее на хирургическом столе. После подготовки мыши к операции, как описано в рукописи, проветривайте мышь 2% изофлураном и 100% кислородом в качестве газа-носителя с использованием коммерческого вентилятора. Затем устанавливают скорость 110 вдохов в минуту, приливный объем 250 микролитров и положительное конечное давление выдоха в четыре миллиметра ртутного столба.
Поверните мышь на 30% на правую сторону, чтобы расположить левую сторону грудной клетки для операции. Затем сделайте двух-трехсантиметровый боковой разрез в коже грудной клетки, чтобы визуализировать грудные мышцы с левой стороны. Сделайте разрез на один сантиметр от средней линии наружу для разрезания большой и малой грудной клетки.
Избегайте чрезмерного кровотечения на протяжении всего прижигания кровоточащих сосудов. Визуализируйте межреберные мышцы между третьим и четвертым ребрами. Сделайте двухсантиметровый разрез в левой межреберной мышце, чтобы ввести воздух в грудную полость и позволить сердцу и легким отпасть от разреза.
Чтобы разрезать межреберный без кровотечения, временно остановите вентилятор и расширите отверстие с помощью прижигающего устройства. Используя втягивающие средства, втягивайте ребра, чтобы обнажить сердце. Затем понаблюдайте за перикардом и нижележащим сердцем под стереомикроскопом.
Аккуратно поместите щипцы на поверхность перикарда, чтобы уменьшить перикард и основное движение сердца. Визуально ориентируют коронарную артерию LAD, прослеживая ее появление под левым придатком. Используя драйвер микроиглы, направьте соответствующий шов через перикард под LAD.
Понаблюдайте за швом, возникающим по другую сторону ЛАД и перикарда. Представляя собой модель постоянной перевязки, завяжите шов, чтобы ограничить кровоток через коронарную артерию, сделав видимым бланширование передней части левого желудочка. Затем обрежьте лишний шов с помощью ножниц.
Проводить поддерживающие инъекции анальгетика подкожно каждые 12 часов в течение 72 часов после операции. После снижения изофлурана до 1% выключают изофлуран при сохранении вентиляции кислородом. Как только животное покажет признаки дыхания, извлеките трахеальную трубку 23 калибра изо рта и поместите мышь в клетку восстановления, чтобы контролировать возобновление дыхания.
Позвольте мыши восстановиться в клетке с частью клетки, помещенной на согревающую площадку, чтобы обеспечить внешний источник тепла. Следите за состоянием здоровья мыши ежедневно в течение семи дней, оценивая разрезы и дискомфорт животных. При необходимости назначают антибиотики для успешного восстановления после инвазивной операции.
После содержания мыши под общим наркозом кислородом поместите мышь в положение лежа на спине на нагретой сценической платформе и прикрепите лапы к проводам ЭКГ. Затем раздражают грудь. Получение изображений ЭКГ с помощью датчика зонда и контактного геля и анализ с помощью соответствующего программного обеспечения.
После неинвазивной оценки ЭКГ выключите изофлуран и верните мышь в клетку. Зафиксируйте сердце в 10% формалине в течение не менее 24 часов. Отрежьте образец с помощью прямого лезвия бритвы через правый желудочек, межжелудочковую перегородку и левый желудочек, гарантируя, что разрез проходит через центр зоны инфаркта.
А затем парафин встраивают образцы тканей. Затем разрезанные секции помещаются в монтажную кассету для дальнейшего встраивания парафина и последующего секционирования на участки толщиной в пять микрометров. После размещения участков тканей на горках депарафинизируют с помощью толуола и градуированного спирта промывки деионизированной водой.
Затем регидратировать. Далее окрашивают срез 0,1% сириуса красным цветом в пикриновой кислоте в течение двух часов при комнатной температуре. Промыть участок 0,5% уксусной кислотой в течение трех минут с последующим промывкой 70% этанолом в течение одной минуты.
Обезвоживание секции с использованием обратного порядка промывок с увеличением и градуированными концентрациями этанола перед установкой для микроскопической оценки. Успешная индукция инфаркта миокарда с модифицированной коронарной перевязкой оценивалась путем изучения функциональных параметров и особенностей строения сердца. Для функции снижение фракции выброса левого желудочка оценивали с помощью эхокардиографии в течение трех-четырех недель после инфаркта миокарда.
Гистологическое окрашивание показало, что функциональные изменения сопровождались значительным фиброзом стенки левого желудочка, что было дополнительно подтверждено количественной оценкой пикрозирного красного окрашенного фиброза в поперечных сечениях сердца через четыре недели после инфаркта с нарушенными или неповрежденными моделями коронарной перевязки перикарда. Сочетание метода флуоресцентной маркировки шариков с анализом проточной цитометрии обеспечило подход к отслеживанию резидентных Gata6 положительных перикардиальных макрофагов. Важно отметить, что в сердце или крови практически не было обнаружено маркировки.
После инфаркта миокарда перемещение клеток может быть отслежено с помощью проточной цитометрии и визуализации. Показана количественная оценка флуоресцентных шариков, меченных перикардиальными миелоидными клетками с инфарктом миокарда или без него. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить непреднамеренное нарушение или разрыв тонкого перикарда во время процедуры.
Этот метод можно комбинировать с прослеживанием линии клеточной или эффекторной блокады, что позволит отслеживать и определять влияние перикардиального компонента на реакцию заживления в инфарктном сердце. Мы идентифицировали полость перикарда, защищающую сердце после травмы, которая частично опосредована резидентными перикардиальными макрофагами. Такой подход открывает новую область исследований сердечно-сосудистых заболеваний.
