Этот метод важен, потому что он может измерять поглощение глюкозы в определенных клетках в живых тканях дрозофилы. Датчик на основе FRET обеспечивает прямое измерение изменений внутриклеточного уровня глюкозы. Этот метод позволяет исследователям оценивать изменения уровня глюкозы в режиме реального времени в живых двигательных нейронах из моделей БАС по сравнению с контрольной группой.
Сложным аспектом является визуализация того же набора нейронов после изменения буфера. Оставление образца на микроскопе помогает гарантировать, что VMC движется как можно меньше. Перед началом вскрытия включают микроскоп и лазеры.
Затем соберите блуждающую третью личинку звезды, промойте ее двойной дистиллированной водой и поместите в каплю буфера HL3 на предварительно приготовленную блюдо с эластомерной подкладкой. Затем под рассекающим микроскопом используйте пару щипцов, чтобы закрепить передний и задний концы личинки, спинной стороной вверх, осторожно растянув личинку по длине с помощью штифтов насекомых. Используя пару угловых ножниц Iris, сделайте разрез чуть выше задней булавки.
Затем делают вертикальный срез от разреза в сторону переднего конца личинки. После добавления нескольких капель буфера HL3, если это необходимо, удалите трахею и остальные плавающие органы, не нарушая центральную нервную систему. Затем зажмите лоскуты, растягивая стенку тела, чтобы обнажить центральную нервную систему, сохраняя при этом нервно-мышечную систему нетронутой.
Для получения изображения используйте вертикальный конфокальный микроскоп с 40-кратной линзой погружения в воду. Затем выберите 405-нанометровый лазер для возбуждения CFP. Затем оптимизируйте параметры сбора, такие как скорость сканирования, среднее значение, цель, размер точечного отверстия и пространственное разрешение.
Отрегулируйте коэффициент усиления таким образом, чтобы сигнал находился в оптимальном динамическом диапазоне и используйте одинаковые параметры для всех генотипов. Чтобы визуализировать двигательные нейроны в вентральном нервном канатике, поместите силиконовую тарелку с рассеченным образцом под линзу и опустите линзу так, чтобы она вступила в контакт с буфером трегалозной сахарозы HL3. Убедитесь, что объектив полностью погружен в буфер и при необходимости добавьте дополнительный буфер. Следующий.
Используя каналы CFP и FRET, вручную выберите оптический выбор, состоящий по меньшей мере из шести двигательных нейронов в фокусе, расположенных вдоль средней линии вентрального нервного канатика. Затем получайте изображения каждые 10 секунд в течение 10 минут. Эти изображения представляют базовую линию.
Для стимуляции глюкозой удалите трегалозную сахарозу, содержащую буфер HL3, с помощью пипетки Пастера и добавьте пять миллимоляров глюкозы, дополненных буфером HL3, не перемещая вентральный нервный канатик. Затем получайте изображения каждые 10 секунд в течение еще 10 минут. Эти изображения представляют фазу стимуляции.
Сохраните изображения в виде файлов CZI или любого типа файлов, поддерживаемого программным обеспечением для обработки изображений, с именем файла, включая дату, генетический фон, экспериментальное состояние и используемые каналы. Повторно используйте параметры для изображения всех генотипов. Для обработки изображений откройте программное обеспечение для обработки изображений Fiji-ImageJ, затем откройте файлы CZI, выберите стек представлений с гиперстеком и установите цветовой режим в шкалу серого и выберите разделение каналов на отдельные окна. Следующий.
Обрабатывайте изображения с помощью плагинов коррекции дрейфа, turbo reg и stack reg. Каждый канал корректируется отдельно, выбирая стек reg в плагинах, а затем выбирая преобразование в трансляцию. Вручную выберите интересующие области или ROI, отслеживая все двигательные нейроны, которые остаются в фокусе в течение всего временного ряда.
Затем используйте менеджер ROI, чтобы сохранить контур каждого двигательного нейрона. Используйте функцию multi measure для измерения среднего значения серого цвета в каждом ROI в каждый момент времени. Затем скопируйте ROI, прослеженные от первого канала ко второму каналу для изображения перед стимуляцией.
Для анализа данных рассчитайте коэффициент FRET по CFP, используя средние значения серого цвета для каналов FRET и CFP. Изменения коэффициентов FRET по CFP отражают изменения внутриклеточной концентрации глюкозы. Затем постройте график FRET по соотношениям CFP для каждой рентабельности инвестиций и точки времени в зависимости от времени.
Генетически закодированный датчик глюкозы на основе FRET использовался для измерения поглощения глюкозы в двигательных нейронах. Когда глюкоза не связана с датчиком, возбуждение CFP вызывает только эмиссию CFP. И когда глюкоза связывается, сигнал YFP может быть обнаружен из-за FRET, возникающего между CFP и YFP.
Здесь показаны изображения сигналов FRET и CFP в элементах управления датчиками глюкозы в мутантных нейронах TDP-43 в исходных условиях и условиях стимуляции. Репрезентативный двигательный нейрон очерчен на каждом изображении в качестве примера ROI. При стимуляции глюкозой контрольные двигательные нейроны, экспрессирующие датчики глюкозы, демонстрируют небольшое увеличение поглощения глюкозы, в то время как нейроны, экспрессирующие TDP-43, показали значительно более высокое поглощение глюкозы.
В дальнейшем коэффициенты FRET по CFP мутантных двигательных нейронов TDP-43 нормализовались для контроля датчиков глюкозы в каждый момент времени. В исходных условиях не было никакой разницы между генотипами. Однако при стимуляции глюкозой у мутантов TDP-43 наблюдалось быстрое и значительное увеличение поглощения глюкозы по сравнению с контролем.
В гистограммном представлении стимуляция глюкозы в нейронах, экспрессирующих датчик глюкозы, продемонстрировала небольшое, но значительное увеличение FRET по соотношению CFP по сравнению с исходным уровнем. Напротив, нейроны, экспрессирующие TDP-43, показали значительное увеличение соотношения при стимуляции по сравнению с исходным уровнем. Чистая разница в коэффициентах FRET по CFP между моторными нейронами, экспрессирующими TDP-43, и датчиком глюкозы составляет около 10,9% Управление временем имеет решающее значение для этой процедуры, чтобы нейроны не умирали в ходе визуализации.
Важно изобразить сразу после вскрытия, чтобы избежать этого. Этот метод подчеркнул важность метаболизма глюкозы в нейронах и привел нашу группу к дальнейшему исследованию роли гликолиза в регенерации двигательных нейронов.
