Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1. Подготовка инструментов и рабочих растворов <ol><li> Приготовьте раствор рыба воды. Сделать исходного раствора путем растворения 2 г морской соли &quot;Instant Ocean&quot; в 50 мл дистиллированной воды. Добавить 1,5 мл фондовом рыбы водой до 1 л дистиллированной воды для приготовления готовых к использованию рыбы воду (60 мкг / мл морские соли конечная концентрация). Автоклав готов к использованию рыбы воду перед использованием. Это решение используется в качестве данио эмбриона среды. </li><li> Подготовка метилцеллюлозы для эмбриона монтажа. Растворить 1,5 г метилцеллюлозы в 50 мл стерильной воды рыбы. Облегчения растворения с помощью магнита на магнитной мешалки. Полное растворение порошка может потребоваться несколько часов. Проверьте решение для ясности и Алиготе в трубочки. Хранить при -20 ° С в течение месяцев и оттаять аликвоты при использовании. Центрифуга метилцеллюлозы при 950 мкг в течение 5 мин перед использованием. Избегайте циклов замерзания-оттаивания из аликвоты. </li><li> Подготовка 50 мл Tricaine / этил 3-аминобензойной кислоты мэтансульфонат соль (исходный раствор) путем растворения 200 мг Tricaine в 100 мл воды и довести рН до 7,0 с помощью трис-HCl 1 М (рН 9). Храните этот запас при 4 ° С в течение не более 30 дней. ВНИМАНИЕ: Tricaine является токсичным. Используйте в соответствии с надлежащих принципов обработки. </li><li> Склонение окислительный стресс у эмбрионов данио рерио <ol><li> Подготовить окислителя решение для общего индукции окислительного стресса: Сделайте 50 мл раствора оксидантов, добавив Н 2 О 2 исходный раствор (перекись водорода; 100 мм) до рыбы воды. Используйте H 2 O 2 из конечной концентрации от 2 мм до 100 мкм. Подготовьте это решение незадолго до использования. Решение окислителя могут быть применены как к целой горе РОС-обнаружения и одноклеточных методов РОС-обнаружения. Не храните это решение. ВНИМАНИЕ: H 2 O 2 опасно, и вреден при вдыхании и проглатывании. Контакт с горючим материалом может вызвать пожар. Ручка под вытяжкой и носить соответствующую челнальных защиты. </li><li> Подготовить окислителя решение для индукции окислительного стресса митохондрий, полученных: Сделайте окислителя маточного раствора (5 мм) путем растворения 3,9 мг ротенона в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Держите это решение при комнатной температуре в темноте. <ol><li> Растворите Ротенон исходного раствора в 10 мл рыбного воды, чтобы сделать готовый к использованию решение. Использование ротенон в концентрации от 5-50 мкМ. Не используйте ротенон в концентрациях, превышающих 100 мкм. В соответствующих концентрациях, это решение окислителя могут быть применены как к целой горе РОС-обнаружения и одноклеточных методов РОС-обнаружения. ВНИМАНИЕ: Ротенон является токсичным и опасным. Ручка в соответствии соответствующие меры предосторожности. </li></ol></li><li> Вызвать окислительный стресс геном нокдауна: бросовым экспрессию генов nrf2a у эмбрионов данио рерио по морфолиногруппой микроинъекции как ранее сообщал Timme-Laragy А. и др., 2012 38.. </li><li> Вызвать OxidAtive стресс после повреждения тканей: генерировать маржу раны в хвостовой плавник эмбрионов данио рерио в 72 часов после оплодотворения, как описано ранее Niethammer др., 2009 39.. </li></ol></li><li> Подготовьте 5 мл раствора РОС-обнаружения для одного клеток методом РОС-обнаружения: <ol><li> Решение для общего обнаружения ROS: Растворите общий РОС-чувствительную молекулярную зонд в HBSS (Хэнкса сбалансированный солевой раствор) в целях подготовки рабочего раствора (диапазон концентрации: 2,5-10 мкм). Это решение должно быть подготовлено незадолго перед использованием. </li><li> Раствор для конкретных обнаружения АФК индуцированной митохондрий: Незадолго до использования, растворить митохондриальную РОС-чувствительный зонд с ДМСО делая 5 мМ маточного раствора. Растворите исходного раствора в HBSS, чтобы подготовить рабочий раствор (диапазон концентрации: 2,5-10 мкм). ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прямого воздействия света и кислорода воздействия РОС-обнаружения рабочих растворов и их соответствующие растворы. Защитите трубу от света с помощьюалюминиевая фольга. Не храните и не повторное использование зондов, растворенные в HBSS. Храните растворы при -20 ° С в течение месяца. ВНИМАНИЕ: Обращайтесь молекулярные зонды и ДМСО под вытяжкой в ​​соответствии с надлежащих принципов. </li></ol></li><li> Подготовьте 5 мл раствора РОС-обнаружения для метода крепления РОС-обнаружения всей: Растворите общий РОС-чувствительный датчик исходного раствора (стабилизированная в ДМСО) в HBSS, чтобы подготовить рабочий раствор (диапазон концентрация: 2,5-5 мкм). Избегайте свет и воздействия кислорода. Защитите трубу от света. Подготовка этого решения перед использованием. Не храните и не используйте повторно это решение. ВНИМАНИЕ: Обращайтесь молекулярных зондов под вытяжкой в ​​соответствии с надлежащих принципов. </li><li> Сделать 25 мл стоп-раствора добавлением 10 мл фетальной бычьей сыворотки в 15 мл PBS 1X. Держите решение стерильными. Храните это решение при 4 ° С. Это решение требуется только для одной ячейки - метод обнаружения РОС. </li><li> Установите данио воздуха инкубатор на 28 &amp;# 176; С. </li><li> Установка центрифуги при 4 ° С для метода ROS обнаружения одной ячейки. </li></ol> 2. Спаривание взрослых рыб и отбор эмбрионов рыбок данио <ol><li> Настройка взрослых данио пара пересекает соответствии со стандартными протоколами 40. Выберите соответствующий трансгенной линии в соответствии с конкретными экспериментальными потребностей. </li><li> Собирайте яйца и поместить их в 90-мм блюдо с рыбой воды / эмбриона среды. Хранить яйца при 28 ° С до тех пор эмбрионы не будет развиваться и расти до желаемой стадии развития (например, 48 часов после оплодотворения, 72 часов после оплодотворения; HPF: часов после оплодотворения). </li><li> Экран для развивающихся эмбрионах. Исключить все неоплодотворенные яйца или слаборазвитые эмбрионов. </li><li> Обезболить эмбрионов путем добавления 1 мл Tricaine (исходный раствор) в 50 мл рыбного воды. </li><li> Выберите эмбрионов люминесцентные ТГ под стереомикроскопом. </li></ol> 3. Лечение эмбрионов с окислителем Агента <ol><li> Используйте как минимум 30 эмбрионов между 48 чпф и 72 часов после оплодотворения в различных условиях. Вымойте эмбрионов дважды свежей рыбы воды, чтобы удалить Tricaine. </li><li> Сплит люминесцентные эмбрионов в трех блюд. Положите не более 30 эмбрионов / блюдо. </li><li> Извлеките промывочного раствора и добавляют 10 мл раствора окислителя или 10 мл воды рыбы, как контрольного раствора. </li><li> Выдержите эмбрионов в течение 10 мин до 1 часа при 28 ° С Инкубационный период зависит от уровня окислительного стресса, индуцированного быть в определенных тканей. Короткие периоды являются лучшими как клетки, затронутые окислительного стресса постепенно пройти гибель клеток. </li><li> Передача эмбрионы в новую чашку, содержащую HBSS и эмбрионов мыть, вращая. Предварительно теплой HBSS при 28 ° С </li></ol> 4. Всего Гора РОС Метод обнаружения <ol><li> Сбор эмбрионов после лечения окислителя и поставить не более 10 эмбрионов в трубочку. Промыть ССРХ как можно больше. Защитите трубу от света с помощью алюминиевой фольги. </li><li> Добавьте 1 мл раствора РОС-обнаружения длякаждая трубка. </li><li> Инкубируйте эмбрионов в темноте в течение 15 мин при 28 ° С для предотвращения попадания света. </li><li> Во время инкубации подготовить на стеклянное скольжение для всей анализа эмбриона. Положите 300 мкл метилцеллюлозы на &quot;депрессия&quot; стекло и распространять его на поверхности стекла с кончика пипетки. Избегайте пузырей при освобождении метилцеллюлозы. </li><li> В конце инкубационного периода, немедленно извлеките решение РОС-обнаружения и мыть дважды 2 мл HBSS. Вымойте эмбрионов путем обращения трубки несколько раз. Не пипетки или вихрь. </li><li> Эмбрионы Аспирируйте до в стеклянную пипетки Пастера. Эмбрионы положении рядом открытии пипетки и осторожно извлечь их в метилцеллюлозы. Ориентируйтесь эмбрионов соответственно с тонкой линии нейлона. </li><li> Сравните флуоресценцию контрольных эмбрионов с обработанных эмбрионов. С другой стороны, закрепить параметры флуоресценции стереомикроскопа или конфокальной микроскопии, так что все эмбрионы отображаемого использованием того жеНастройки визуализации. </li></ol> Single Cell Метод РОС-5 обнаружения. <ol><li> Начните с шага: 3.5. Убедитесь в том, чтобы иметь по крайней мере 35 эмбрионов для каждого условия. </li><li> Трансфер эмбрионов в новое блюдо. Удалить воде рыба как можно больше. Добавьте 10 мл ледяной PBS 1X и 400 мкл ингибиторов протеазы коктейль. Вручную dechorionate эмбрионов щипцами и удалить желток мешок с тонкой иглой. Примечание: Удаление желтка мешок обеспечивает чистые образцы для последующего анализа FACS. Этот шаг может быть предотвращено в соответствии с FACS инструмента. </li><li> Передача де-yolked эмбрионов в 24-а многоямного пластины (15 эмбрионов / лунку) и удалить все рыбы воды. </li><li> Добавить 300 мкл HBSS, 30 мкл коллагеназы P 50 мкл трипсина-ЭДТА в каждую лунку. </li><li> Гомогенизируют эмбрионов, осторожно пипеткой вверх и вниз с плотно кончика пипетки (1000 мкл). </li><li> Инкубируют при 28 ° С в течение 20 мин и гомогенизируют с помощью пипетки образцы каждые 5 мин. </li><li> Проверьте ткани DISRuption наблюдая аликвоты гомогената в микроскоп соединения. Содействие суспензии отдельных клеток с помощью пипетки. Не инкубировать эмбрионов в течение более 30 мин. </li><li> Остановите реакцию добавлением 200 мкл стоп-раствора. Смешайте с помощью пипетки осторожно. </li><li> Передача клеточной суспензии в предварительно охлажденной трубки с жесткой нижней части. Держите трубку на льду и предотвращения попадания света. </li><li> Центрифуга в течение 5 мин при 250 х г при 4 ° С. </li><li> Снимите верхнюю фазу и вновь приостановить клеток с ледяной ССРХ, осторожно пипеткой. </li><li> Граф клеток и убедитесь, что у вас есть такое же количество клеток во всех ваших образцов. Не используйте менее 2 х 10 6 клеток. </li><li> Центрифуга клетки в течение 5 мин при 250 х г при 4 ° C. </li><li> Удалить супернатант и приостановить гранул с 1 мл ледяной охлажденной ССРХ содержащих РОС-чувствительный датчик. </li><li> Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 3 мин в темноте. Vary время инкубации в соответствии с уровнем окислительного стресса и тон чувствительность датчика. </li><li> Трансфер клетки к FACS трубы. Держите пробирки на лед и предотвращения попадания света перед анализом FACS. </li><li> Сортировки клеток с флуоресцентно-активированном клеточном сортере (FACS). Набор длины волн в соответствии с Tg ткани флуоресценции (например, GFP) и спектров возбуждения / эмиссии молекулярного зонда, используемого для обнаружения ROS (например, конкретных митохондриальных АФК-чувствительных датчиков, родовых РОС-чувствительных датчиков). </li><li> Для каждого условия, измерить все образцы в течение той же экспериментальной сессии, применяя те же настройки FACS. Рассчитать процент флуоресцентных клеток как среднего различных биологических повторяет. Анализ по меньшей мере два повторов для каждого состояния. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Критические шаги Порядок окислительного обнаружении напряжения у эмбрионов рыбок данио, описанных здесь, включает в себя два различных метода. Весь метод крепления РОС-обнаружения в основном качественный анализ для РОС-обнаружения, а метод РОС-обнаружение одной клетки ...

Окислительный стресс специально определяется как состояние, что результаты от неуравновешенное состояние сотовой окислительно-восстановительной. Сложные окислительно-восстановительные реакции, которые обычно происходят в клетках определения клеточной редокс-состояние. Окислительно-восстановительные реакции состоит из всех химических реакций, которые состоят в передаче электронов между атомами биологических молекул, производящих восстановление и окисление молекул (то есть окислительно-восстановительных реакций). Эти реакции катализируется электронном активированных видов (т.е. про-окислительные видов), которые характеризуются крайней структурной неустойчивости и спонтанной активации неуравновешенных электронов, которые обмениваются с соседними биомолекул. Эти неправильные реакции приводят в повреждении ДНК, белка карбоксилирования, и окисление липидов, и в конечном итоге привести к гибели клеток 1. Повышенные уровни оксидативного стресса были связаны со старением и прогрессировании различных патологических состояний 2. Окислительный стресс имеетСообщалось, что ответственность за сосудистых изменений в диабет и сердечно-сосудистых заболеваний 3,4. Он также играет важную роль в дегенерации нейронов при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона 5. Кроме того, окислительный стресс была продемонстрирована в качестве важнейшего фактора в управлении прогрессирование рака и метастатических события 6,7. Кроме того, воспаление и иммунный ответ может вызвать и дальнейшее сопровождение окислительный стресс 8. В живых клетках, про-окислительные видов являются производными от кислорода (ROS; активных форм кислорода) или азота (RNS; видов активного азота). ROS включают гидроксильный радикал, в супероксид-анион (OH). (O 2 -) и перекись водорода (H 2 O 2). Первичный RNS является закись азота (NO.). Ряд вторичных активных форм могут быть получены путем взаимодействия спонтанных betweeн АФК и RNS или свободных металлов ионов 9. Например, супероксид-анион реагирует с закисью азота с образованием пероксинитрат (ONOO -), в то время как H 2 O 2 в реакцию с Fe 2 + генерирует гидроксильные радикалы. АФК и RNS, из-за их способности реагировать с несколько биомолекул, считаются опасной угрозой для поддержания физиологического состояния окислительно-восстановительного 10. Чтобы поддерживать окислительно-восстановительное состояние клетки снабжены серией детоксикации молекул антиоксидантными и ферменты. Супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы и Пероксиредоксины существу составляют антиоксидантным ферментативную-арсенал, который обеспечивает сотовой защиты от про-окислительных видов в том числе H 2 O 2, ОН и Oono -. 11. Также молекулы антиоксиданта, как витамин С и Е, полифенолы и CoenzymeQ10 (коэнзима Q10) имеют решающее значение для утоления ROS и их опасного деrivatives 12,13. Однако избыточное производство АФК и RNS, или дисфункции в системе Антиоксидант, сдвигает клеточный редокс-состояние к окислительному стрессу 14. Кроме того, их негативный оттенок, ROS могут играть различные физиологические роли в клетках различного происхождения. Клетки обычно производят ROS как сигнальные молекулы в качестве посредника нормальные биологические события, такие как хост-защиту и заживления ран 15-17. Активные формы обычно получают в клетках путем внутриклеточных ферментов, таких как NOx (НАДФН-оксидазы) и XO (ксантина оксидазы) в ответ на сигнальных факторов, факторов роста и внутриклеточных колебаний уровней кальция 18,19. Было сообщено, что ROS может дифференциально модулировать активность важных ядерных факторов, таких как p53 или клеточных компонентов, таких как ATM-киназы, мастер регулятора ответ на повреждение ДНК 20. Аналогично АФК сильно влияют сотовой сигнализации на посредничество тыс.э окисления и инактивация белка тирозина фосфатазы (PTPs), которые устанавливаются в качестве важнейших регуляторов передачи сигнала 21. Кроме того, протеомные основе методологии продемонстрировать, что RNS также несут ответственность за конкретные изменения белковых и изменений молекулярной сигнализации. RNS реагировать с цистеином тиоловых групп модифицирующих их в S-nitrothiols (SNO) и молекулярных путей, вызывающих одновременно с патологических состояний, таких как воспалительных и аутоиммунных заболеваний 22,23. Поскольку культура клеток эксперименты лишь частично воспроизвести множество факторов, действующих в естественных условиях, это представляет большой интерес для выполнения окислительно-восстановительные исследования на животных моделях 24,25. Чтобы достичь этого, данио рерио был рассмотрен подходит позвоночных животной модели для исследования динамики окислительные стресс 26. Данио это новая модель системы, которая предоставляет ряд преимуществ для изучения клеточных и генетических событий во позвоночных разработчикаelopment и болезни. Большие кластеры эмбрионов могут быть получены и доступны в неделю в течение эксперимента потребностей. Кроме того, внеочередное оптическая прозрачность из эмбрионов данио рерио, а также их небольшой размер, позволяет один визуализации клеток и динамический трекинг в целом организмов 27. В последнее десятилетие, значительное число рыбок данио мутантов были получены для моделирования человеческих патологических состояний, таких как рак и генетические заболевания 28-31. Самое главное, множество трансгенных линий был произведен, чтобы позволить широкие возможности генетических и биологических манипуляций 32. Например, трансгенные тканеспецифические данио линии регулярно используются для естественных условиях исследования в. Эти строки выражают флуоресцентный белок под контролем выбранного промоутер, предлагая возможность идентифицировать отдельные клетки в естественных условиях, а также анатомическое строение они составляют. Несколько токсикологические исследования уже используются тон данио рерио, чтобы оценить эффект в естественных условиях на окислительно-восстановительного гомеостаза химических веществ, что свидетельствует о пригодности этой позвоночных как животной модели для области лекарственных препаратов и окислительного стресса 33-35. Хотя некоторые флуоресцентные зонды были протестированы для мониторинга окислительного стресса у рыбок данио личинки 36,37, нет никаких установленных анализы для обнаружения и измерения уровня оксидативного стресса у рыбок данио тканей и живые клетки. Здесь мы опишем процедуру количественного в естественных условиях окислительного стресса в живых клетках эмбрионов данио рерио. Обработки изображений инструменты, СУИМ сортировка, флуоресцентные зонды и про-окислительные условия все объединены для создания простого анализа для обнаружения и количественного определения окислительных видов у эмбрионов рыбок данио и тканей.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

Высокие уровни активных форм кислорода (АФК) может вызвать изменение состояния сотовой окислительно-восстановительного к окислительному состоянии стресса. Эта ситуация вызывает окисление молекул (липидов, ДНК, белков) и приводит к гибели клеток. Окислительный стресс также влияет на прогрессирование нескольких патологических состояний, таких как диабет, ретинопатия, нейродегенеративные и рак. Таким образом, важно определить инструменты для исследования окислительных условиях стресса не только на уровне одиночных клеток, но также в контексте целых организмов. Здесь мы рассмотрим данио эмбриона в качестве полезного в системе естественных условиях для выполнения таких исследований и приводим протокол для измерения в естественных условиях окислительного стресса. Воспользовавшись люминесцентных АФК зондов и рыбок данио трансгенных флуоресцентных линий мы разрабатываем два различных метода для измерения окислительного стресса в естественных условиях: I) &quot;Весь эмбрион метод РОС-обнаружение&quot; для качественного измерения окислительного стресса и б) А &quot;одноклеточных РОС метод обнаружения &quot;для количественных измерений окислительного стресса. В данном случае мы демонстрируют эффективность этих процедур, увеличивая окислительный стресс в тканях путем окислительных агентов и физиологических или генетических методов. Этот протокол является поддаются для форвардных генетических экранов, и это поможет адрес причинно-следственных связей АФК на животных моделях окислительного стресса, связанных патологий, таких как неврологические расстройства и рак.

Применяя метод здесь описанное, мы можем легко измерить и обнаружить окислительный стресс (и уровни ROS) в данио эмбриональных тканей. После пересечения взрослых данио, яйца собирают и позволили разработать при 28 ° С до 72 ч после оплодотворения (HPF). Для того, чтобы вызвать оксидативный ст?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

36.9K Views.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Video: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Анализ апоптоза у эмбрионов данио рерио по целом монтажа иммунофлуоресценции для обнаружения активированного каспазы 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Производство гаплоидных эмбрионов данио по<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Оплодотворение

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Комет в качестве косвенного измерения системных окислительного стресса

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...