Настоящая технология позволяет использовать антитела, выращенные у одного вида, для обнаружения до семи маркеров. Продемонстрировать процедуру будет Лусия Чан, техник из лаборатории. Начните с подготовки формалиновых фиксированных парафиновых стеклянных слайдов, установленных вместе с образцом ткани, поместив слайды в духовку, чтобы выпекать при температуре 60 градусов цельсия с тканью, обращенной вверх.
Через час очистите воск и регидратируйте слайды в течение 10 минут каждый с серией химических веществ, как описано в рукописи. Погрузите слайды в трис-буферизованный физиологический раствор, а затем в пластиковую коробку для слайдов, заполненную смесью формальдегида, разбавленного в метаноле, чтобы зафиксировать образцы. Затем дважды промойте горки в деионизированной воде в течение двух минут.
Приступайте к извлечению эпитопов, поместив стойку слайдов в термостойкий ящик, заполненный буфером лимонной кислоты при рН 6,0. А затем поместите коробку в микроволновую печь, чтобы нагреть слайды сначала на 100% мощности в течение 50 секунд, затем 20 минут на 20% мощности, чтобы поддерживать ту же температуру. После промывки горок в дистиллированной воде и промывки TBST, погрузите горку в банку, содержащую раствор, блокирующий перекисное окисление, на 10 минут.
После инкубации промойте горки в дистиллированной воде и промойте TBST, затем используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы отметить границу вокруг участка ткани на слайде. Затем промойте горку в TBST, накройте участки тканей блокирующим буфером и высиживайте слайды в увлажненной камере в течение 15 минут. Чтобы удалить блокирующие реагенты, сначала инкубируют слайды с первичным антителом, представляющим интерес, а затем удаляют первичное антитело, промывая слайды трижды TBST, перед инкубацией с полимерной пероксидазой полимерного хрена, меченым вторичным антителом.
После инкубации промыть слайды перед нанесением опаловой флоры на рабочий раствор TSA, а затем промыть горку буфером извлечения антигена. Выполните зачистку на основе микроволновой печи, нагревая слайды в буфере извлечения антигена в микроволновой печи на 100% мощности в течение 50 секунд, а затем 20% мощности в течение 20 минут в контейнерах, безопасных для микроволновой печи. После охлаждения образцов при комнатной температуре в течение 15 минут промойте горки в дистиллированной воде и TBST, а затем инкубируйте с раствором dappy в течение пяти минут.
Затем высушите горку на воздухе перед монтажом с помощью соответствующего монтажного носителя. Перед созданием изображения слайдов предварительно установите соответствующие фильтры в рабочей станции. Захватите не менее 10 полей для анализа при 200-кратном увеличении.
Чтобы подсчитать ячейки, нажмите на кнопку подсчета объектов на панели шагов, чтобы отобразить панель настроек подсчета объектов. Если ткань сегментирована, выберите категорию тканей, в которой объекты должны быть найдены. Затем выберите нужное масштабирование сигнала из автоматического масштабирования или фиксированного масштаба.
Для сегментации объектов выберите основной компонент из раскрывающегося списка. Чтобы обнаружить объекты, соприкасающиеся с другими объектами, как отдельные, а не объединенные объекты, установите флажок Максимальный размер и пиксели, а затем выберите уточненное разделение. Затем подсчитайте все стромальные клетки в иммунных клетках отдельно, чтобы выразить данные в процентах иммунных клеток относительно общего количества стромальных клеток для каждого захваченного изображения.
Позже отобразите итоговое количество ячеек как среднее значение всех полей. С помощью редактора представлений изучите полученные таблицы данных после обработки, а затем экспортируйте таблицу данных счетчика. В репрезентативном анализе четыре типа иммунных клеток в образце эндометрия мы дифференцированы.
Обработанное изображение показывает сегментацию тканей как эпителиальных, так и стромальных компартментов. Мультиплексное иммуноокрашивание было выполнено на биопсии эндометрия у фертильной контрольной женщины и женщины с необъяснимым рецидивирующим выкидышем, один пол для нас, представляющий CD3, CD56, CD68 и CD20, были выявлены в иммуноокрашивании. Как только иммунный звук был идентифицирован, дальнейшее окрашивание под цитокином может помочь решить их взаимодействие и механизм успеха имплантации.
