Tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada de cuatro tipos de células inmunes endometriales en aborto espontáneo recurrente

La tecnología actual permite el uso de anticuerpos criados en la misma especie para detectar hasta siete marcadores. La demostración del procedimiento estará a cargo de Loucia Chan, técnica del laboratorio. Comience preparando los portaobjetos de vidrio incrustados de parafina fija de formalina montados con la muestra de tejido, colocando los portaobjetos planos en un horno, para hornear a 60 grados centígrados con el tejido hacia arriba.

Después de una hora, descere y rehidrate las diapositivas cada 10 minutos cada una con la serie de productos químicos, como se describe en el manuscrito. Sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con tris, y luego en una caja de diapositivas de plástico llena de una mezcla de formaldehído diluido en metanol, para fijar las muestras. A continuación, lave los toboganes dos veces en agua desionizada durante dos minutos.

Proceda a la recuperación del epítopo, colocando el bastidor de portaobjetos en una caja de resistencia al calor llena de tampón de ácido cítrico a pH 6.0. Y luego colocar la caja en el microondas, para calentar las diapositivas primero al 100% de potencia durante 50 segundos, seguido de 20 minutos al 20% de potencia, para mantener la misma temperatura. Después de enjuagar los portaobjetos en agua destilada y lavarlos con TBST, sumerja el portaobjetos en un frasco que contenga una solución de bloqueo de peroxidación durante 10 minutos.

Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en agua destilada y lávese con TBST, luego use una pluma de barrera hidrofóbica para marcar un límite alrededor de la sección de tejido en el portaobjetos. Luego enjuague el portaobjetos en TBST, cubra las secciones de tejido con el tampón de bloqueo e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 15 minutos. Para eliminar los reactivos de bloqueo, primero incube los portaobjetos con el anticuerpo primario de interés y luego elimine el anticuerpo primario lavando los portaobjetos tres veces con TBST, antes de incubarlos con el polímero de rábano picante peroxidasa marcado, anticuerpo secundario.

Después de la incubación, lave las diapositivas antes de aplicar la flora opal para la solución de trabajo TSA y luego enjuague la diapositiva con el tampón de recuperación de antígenos. Realice el desmontaje basado en microondas calentando las diapositivas en el búfer de recuperación de antígenos en un microondas al 100% de potencia, durante 50 segundos, seguido de un 20% de potencia durante 20 minutos en los contenedores seguros para microondas. Después de enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos, enjuague los portaobjetos en agua destilada y TBST y luego incube con una solución dappy durante cinco minutos.

A continuación, seque al aire la corredera antes de montarla con el medio de montaje adecuado. Antes de obtener imágenes de las diapositivas, preestablezca los filtros apropiados en la estación de trabajo. Capture un mínimo de 10 campos para su análisis con un aumento de 200 veces.

Para contar las celdas, haga clic en el botón contar objetos en la barra de pasos, para mostrar el panel de configuración de conteo de objetos. Si el tejido se ha segmentado, seleccione la categoría de tejido en la que se encuentran los objetos. A continuación, seleccione la escala de señal deseada de escala automática o escala fija.

Para la segmentación de objetos, seleccione el componente principal en la lista desplegable. Para detectar objetos que tocan otros objetos como objetos individuales y no combinados, marque la casilla tamaño máximo y píxeles y luego opte por la división refinada. A continuación, cuente todas las células estromales en las células inmunes por separado, para expresar los datos como los porcentajes de las células inmunes en relación con el número total de células estromales para cada imagen capturada.

Más tarde, informe el recuento final de celdas como un promedio de todos los campos. Con el editor de vistas, examine las tablas de datos resultantes después del procesamiento y, a continuación, exporte la tabla de datos de recuento. En el análisis representativo, se diferencian cuatro tipos de células inmunes en la muestra de endometrio.

La imagen procesada muestra la segmentación tisular como compartimentos epiteliales y estromales. La inmunotinción multiplex se realizó en las biopsias endometriales de una mujer control fértil y una mujer con aborto espontáneo recurrente inexplicable, se reveló un solo piso para nosotros que representa CD3, CD56, CD68 y CD20 en la inmunotinción. Una vez que se ha identificado el sonido inmunológico, una mayor tinción debajo de la citoquina puede ayudar a abordar su interacción y mecanismo para el éxito de la implantación.