再発流産における4種類の子宮内膜免疫細胞型の多重化蛍光免疫物質化学的染色

本技術は、最大7つのマーカーを検出するために同じ種で育てられた抗体の使用を可能にする。手順を実証することは、研究室の技術者ルーシア・チャンです。ホルマリン固定パラフィン埋め込みガラススライドを組織サンプルに取り付けたスライドを準備し、スライドをオーブンに平らに置き、上向きの組織で摂氏60度で焼く。

1時間後、原稿に記載されているように、10分ごとにスライドを脱ワックスし、水分補給します。トリスバッファー塩水にスライドを沈め、次にメタノールで希釈したホルムアルデヒドの混合物で満たされたプラスチック製のスライドボックスに、サンプルを固定します。次に、滑り台を脱イオン水で2回2分間洗います。

pH 6.0でクエン酸バッファーを充填した耐熱ボックスにスライドのラックを配置することにより、エピトープ検索に進みます。次いで、箱をマイクロ波に入れ、スライドを100%の電力で50秒間加熱し、次いで20分を20%の電力で加熱し、同じ温度を維持する。スライドを蒸留水で洗い流し、TBSTで洗浄した後、過酸化阻止溶液を含む瓶にスライドを10分間浸します。

インキュベーションの後、蒸留水でスライドを洗い流し、TBSTで洗浄し、疎水性バリアペンを使用してスライド上の組織セクションの周りの境界をマークします。次に、TBSTでスライドをすすい、ブロッキングバッファーで組織切片を覆い、加湿チャンバーで15分間スライドをインキュベートします。ブロッキング試薬を除去するために、まず目的の一次抗体でスライドをインキュベートし、次にTBSTでスライドを3回洗浄して一次抗体を除去し、ポリマーワサビペルオキシダーゼ標識を用いてインキュベートする前に、二次抗体を標識する。

インキュベーションに続いて、TSA作業溶液用オパールフローラを塗布する前にスライドを洗浄し、次に抗原検索バッファーでスライドを洗い流します。マイクロ波安全容器で20分間、マイクロ波の安全容器で20%の電力を20秒間、マイクロ波で100%の電力で、抗原検索バッファー内のスライドをマイクロ波で加熱することにより、マイクロ波ベースのストリッピングを行います。サンプルを室温で15分間冷却した後、蒸留水とTBSTでスライドを洗い流し、後でダッピー溶液で5分間インキュベートします。

次に、適切な取り付け媒体で取り付ける前にスライドを空気乾燥させます。スライドのイメージングの前に、ワークステーションで適切なフィルタを事前に設定します。200倍の倍率で分析するために、最低10フィールドをキャプチャします。

セルをカウントするには、ステップバーのカウントオブジェクトボタンをクリックして、オブジェクトカウント設定パネルを表示します。組織がセグメント化されている場合は、対象物が見つかる組織カテゴリを選択します。次に、自動スケールまたは固定スケールから目的の信号スケーリングを選択します。

オブジェクトセグメンテーションの場合は、ドロップダウン リストからプライマリ コンポーネントを選択します。結合されたオブジェクトではなく、個別のオブジェクトとして他のオブジェクトに触れているオブジェクトを検出するには、[最大サイズとピクセル]ボックスをオンにして、分割を細かく選択します。次に、免疫細胞内のすべての間質細胞を別々にカウントし、各撮影画像の全体の間質細胞数に対する免疫細胞の割合としてデータを発現させる。

その後、最終的なセル数をすべてのフィールドの平均として報告します。ビュー エディターを使用して、結果のデータ テーブルを後処理で確認し、カウント データ テーブルをエクスポートします。代表的な分析では、子宮内膜サンプル内の4つの免疫細胞タイプが分化しています。

処理された画像は、上皮、および間質コンパートメントとしての組織のセグメンテーションを示しています。多重免疫染色は、肥沃な対照女性と原因不明の再発流産を有する女性からの子宮内膜生検に対して行われ、CD3、CD56、CD68、およびCD20を代表する私たちのための単一階が免疫染色で明らかになった。免疫音が特定されると、サイトカインの下でさらに染色することは、移植の成功のためのそれらの相互作用およびメカニズムに対処するのに役立ちます。