Mevcut teknoloji, yedi işaretleyiciye kadar tespit etmek için aynı türlerde yetiştirilen antikorların kullanılmasına izin verir. Prosedürü gösteren loucia Chan, laboratuvardan bir teknisyen. Doku örneğine monte edilmiş formalin sabit parafin gömülü cam slaytları hazırlayarak, slaytları bir fırına düz bir şekilde yerleştirerek, doku yukarı bakacak şekilde 60 santigrat derecede pişirmek için başlayın.
Bir saat sonra, el yazmasında açıklandığı gibi, her biri 10 dakikada bir kimyasallar dizisiyle slaytları cilalayın ve yeniden sulayın. Slaytları tris tamponlu salinlere batırın ve ardından numuneleri düzeltmek için metanol ile seyreltilmiş formaldehit karışımı ile dolu plastik bir slayt kutusuna koyun. Ardından, slaytları iki dakika boyunca deiyonize suda iki kez yıkayın.
Slayt rafını pH 6.0'da sitrik asit tamponu ile dolu bir ısı direnci kutusuna yerleştirerek epitope alımına devam edin. Ve sonra kutuyu mikrodalga fırına yerleştirin, slaytları ilk önce 50 saniye boyunca% 100 güçte ısıtmak için, ardından aynı sıcaklığı korumak için% 20 güçte 20 dakika. Slaytları damıtılmış suda duruladıktan ve TBST ile yıkadıktan sonra, slaytı 10 dakika boyunca peroksidasyon engelleme çözeltisi içeren bir kavanoza daldırin.
Kuluçkadan sonra, slaytları damıtılmış suda durulayın ve TBST ile yıkayın, ardından slayttaki doku bölümünün etrafındaki bir sınırı işaretlemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Daha sonra slaydı TBST'de durulayın, doku bölümlerini blokaj tamponu ile örtün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada 15 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Bloklama reaktiflerini çıkarmak için, önce slaytları birincil ilgi antikoru ile kuluçkaya yatırın ve daha sonra ikincil antikor etiketli polimer yaban turpu peroksidaz etiketli inkübasyondan önce slaytları TBST ile üç kez yıkayarak birincil antikoru çıkarın.
Kuluçkadan sonra, TSA çalışma çözeltisi için Opal florasını uygulamadan önce slaytları yıkayın ve ardından slaydı antijen alma tamponu ile durulayın. Mikrodalga tabanlı sıyırma, mikrodalgada antijen alma tamponundaki slaytları mikrodalgada % 100 güçte, 50 saniye boyunca ısıtarak ve ardından mikrodalga güvenli kaplarda 20 dakika boyunca% 20 güçte ısıtarak mikrodalga bazlı sıyırma gerçekleştirin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika soğutun, slaytları damıtılmış suda ve TBST'de durulayın ve daha sonra dappy çözeltisi ile beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra uygun montaj ortamı ile monte etmeden önce kaydırağı havayla kurulayın. Slaytların görüntülenmesinden önce, iş istasyonundaki uygun filtreleri önceden ayarlar. 200 kat büyütme altında analiz için en az 10 alan yakalayın.
Hücreleri saymak için, nesne sayma ayarları panelini görüntülemek üzere adım çubuğundaki nesneleri say düğmesini tıklatın. Doku parçalanmışsa, nesnelerin bulunacağı doku kategorisini seçin. Ardından otomatik ölçekleme veya sabit ölçekten istediğiniz sinyal ölçeklendirmesini seçin.
Nesne segmentasyonu için, açılan listeden birincil bileşeni seçin. Diğer nesnelere dokunan nesneleri tek tek ve birleşik olmayan nesneler olarak algılamak için, en büyük boyut ve piksel kutusunu işaretleyin ve ardından rafine bölmeyi seçin. Daha sonra, verileri yakalanan her görüntü için toplam stromal hücre sayısına göre bağışıklık hücrelerinin yüzdeleri olarak ifade etmek için bağışıklık hücrelerindeki tüm stromal hücreleri ayrı ayrı sayın.
Daha sonra, son hücre sayısını tüm alanların ortalaması olarak bildirin. Görünüm düzenleyicisini kullanarak, işlem sonrası elde edilen veri tablolarını inceleyin ve sonra sayım veri tablosunu dışarı verin. Temsili analizde, endometrium örneğinde dört bağışıklık hücresi tipi farklılaştırıldı.
İşlenen görüntü doku segmentasyonunu epitel ve stromal bölmeler olarak gösterir. Multiplks immünostaining, doğurgan bir kontrol kadınından endometriyal biyopsiler üzerinde yapıldı ve açıklanamayan tekrarlayan düşük yapan bir kadın, bizim için CD3, CD56, CD68 ve CD20'yi temsil eden tek kat immünostainingde ortaya çıktı. Bağışıklık sesi belirlendikten sonra, sitokin altında daha fazla lekelenme, implantasyon başarısı için etkileşimlerini ve mekanizmalarını ele almaya yardımcı olabilir.
