Die derzeitige Technologie ermöglicht die Verwendung von Antikörpern, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um bis zu sieben Marker nachzuweisen. Das Verfahren wird von Loucia Chan, einem Techniker aus dem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der formalinfesten paraffininierten Glasobjektträger, die mit der Gewebeprobe montiert sind, indem Sie die Objektträger flach in einen Ofen legen, um bei 60 Grad Celsius mit dem Gewebe nach oben zu backen.
Nach einer Stunde entwachsen und rehydrieren Sie die Objektträger pro 10 Minuten mit der Reihe von Chemikalien, wie im Manuskript beschrieben. Tauchen Sie die Objektträger in tris-gepufferte Kochsalzlösung und dann in einen Kunststoff-Objektträgerkasten, der mit einer Mischung aus in Methanol verdünntem Formaldehyd gefüllt ist, um die Proben zu fixieren. Als nächstes waschen Sie die Folien zweimal in entionisiertem Wasser für zwei Minuten.
Fahren Sie mit der Epitopentnahme fort, indem Sie das Dia-Rack in eine Hitzewiderstandsbox legen, die mit Zitronensäurepuffer bei pH 6,0 gefüllt ist. Und dann legen Sie die Box in die Mikrowelle, um die Folien zuerst mit 100% Leistung für 50 Sekunden zu erhitzen, gefolgt von 20 Minuten bei 20% Leistung, um die gleiche Temperatur zu halten. Nachdem Sie die Objektträger in destilliertem Wasser gespült und mit TBST gewaschen haben, tauchen Sie den Objektträger 10 Minuten lang in ein Glas mit einer Peroxidationsblockierungslösung.
Nach der Inkubation spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser ab und waschen Sie sie mit TBST, dann verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Grenze um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu markieren. Spülen Sie dann den Objektträger in TBST, bedecken Sie die Gewebeabschnitte mit dem Blockierenpuffer und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 15 Minuten. Um die blockierenden Reagenzien zu entfernen, inkubieren Sie zuerst die Objektträger mit dem primären Antikörper von Interesse und entfernen Sie dann den primären Antikörper, indem Sie die Objektträger dreimal mit TBST waschen, bevor Sie mit der Polymer-Meerrettichperoxidase markierten sekundären Antikörper inkubieren.
Waschen Sie nach der Inkubation die Objektträger, bevor Sie die Opalflora für die TSA-Arbeitslösung auftragen, und spülen Sie den Objektträger dann mit dem Antigen-Retrieval-Puffer ab. Führen Sie das mikrowellenbasierte Stripping durch, indem Sie die Objektträger in einem Antigen-Retrieval-Puffer in einer Mikrowelle bei 100% Leistung für 50 Sekunden erhitzen, gefolgt von 20% Leistung für 20 Minuten in den mikrowellensicheren Behältern. Nachdem die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt sind, spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser und TBST ab und inkubieren Sie sie später fünf Minuten lang mit Dappy-Lösung.
Anschließend trocknen Sie den Schlitten vor der Montage mit dem entsprechenden Montagemedium an der Luft. Vor der Bebilderung der Dias werden die entsprechenden Filter in der Workstation voreingestellt. Erfassen Sie mindestens 10 Felder für die Analyse unter 200-facher Vergrößerung.
Um die Zellen zu zählen, klicken Sie auf die Schaltfläche Objekte zählen in der Schrittleiste, um das Einstellungsfenster für die Objektzählung anzuzeigen. Wenn das Gewebe segmentiert wurde, wählen Sie die Gewebekategorie aus, in der die Objekte zu finden sind. Wählen Sie dann die gewünschte Signalskalierung aus automatischer Skalierung oder fester Skalierung aus.
Wählen Sie für die Objektsegmentierung die Hauptkomponente aus der Dropdown-Liste aus. Um Objekte zu erkennen, die andere Objekte berühren, als einzelne und nicht kombinierte Objekte, aktivieren Sie das Kontrollkästchen maximale Größe und Pixel und entscheiden Sie sich dann für die verfeinerte Aufteilung. Als nächstes zählen Sie alle Stromazellen in den Immunzellen separat, um die Daten als Prozentsatz der Immunzellen relativ zur Gesamtzahl der Stromazellen für jedes aufgenommene Bild auszudrücken.
Geben Sie später die endgültige Zellanzahl als Durchschnitt aller Felder an. Untersuchen Sie mit dem Ansichtseditor die resultierenden Datentabellen nach der Verarbeitung und exportieren Sie dann die Zähldatentabelle. In der repräsentativen Analyse werden wir vier Immunzelltypen in der Endometriumprobe differenziert.
Das bearbeitete Bild zeigt die Gewebesegmentierung als Epithel- und Stromakompartimente. Das Multiplex-Immunostaining wurde an den Endometriumbiopsien einer fruchtbaren Kontrollfrau und einer Frau mit unerklärlichen rezidivierenden Fehlgeburten durchgeführt, wobei ein einziger Boden für uns, der CD3, CD56, CD68 und CD20 darstellt, in der Immunfärbung aufgedeckt wurde. Sobald der Immunschall identifiziert wurde, kann eine weitere Färbung unter dem Zytokin helfen, ihre Interaktion und ihren Mechanismus für den Implantationserfolg zu adressieren.
